Name: ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: اكتشف طريقة فحص عالية الإنتاجية لنشاط الإندوغلوكاناز الفطري في E. coli باستخدام صبغة Congo Red. تتيح هذه التقنية تقييمًا بصريًا سريعًا للنشاط الإنزيمي دون الحاجة إلى تنقية البروتين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل غوردون وبيتي مور مؤسسة ، ومبادرة العلوم UNCF / ميرك.

1. فحص لوحة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25G متوسط ​​النمو LB ، أغار 15G ، و1.5G carboxymethyl السليلوز (CMC) الركيزة إلى الماء المقطر 1L ، وتعقيم لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعقيم ، والسماح لتبرد والمتوسطة إضافة المضادات الحيوية المناسبة ، وإلى تركيز IPTG النهائي 100μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 200mL المتوسطة في كل كبيرة 5 أطباق بتري مربعا / صواني الأحيائي (240 × 240 × 20mm أو أكبر). السماح لوحات لتجف تماما. </li></ol> 2. مكتبة الجيل Endoglucanase والشاشة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مكتبة الملك endoglucanase الحفاز (ق). ويمكن تحقيق ذلك بطرق عديدة (على سبيل المثال ، موقع الموجه أو الطفرات العشوائية ، إعادة التركيب ، وغيرها) ويتم تحديد من قبل الباحث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ المكتبة الى ناقلات بحيث يكونون تحت سيطرة المروج T7 مع مشغل لبن ، وتحتوي على تسلسل pelB إشارة لاستهداف لالجبلة المحيطية. مثال على ناقل غير مناسبة pET22b (+) من Novagen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الى المكتبة endoglucanase E. القولونية BL21 سلالة (DE3) وطبق على المستعمرات واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين عشية وضحاها تحول احتضان عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المسواك عقيمة ، تلقيح الحيوانات المستنسخة في 96 بئر عميقة لوحات تحتوي على رفاه 400μL المتوسطة LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 96 الجلسرين العقيمة الثقافات بين عشية وضحاها أيضا إلى التركيز النهائي من 10 ٪ على المدى الطويل في تخزين -80 درجة مئوية. وسوف يكون هذا الطبق الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الطوابع 96 - دبوس ، وتكرار لوحة الثقافات بين عشية وضحاها على لوحات تحتوي على الفرز IPTG واللجنة العسكرية المركزية. يمكن أن تكون مختومة تصل إلى 5 مجموعات من الثقافات بين عشية وضحاها على كل لوحة الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات التسمية الفرز بحيث يعرف هوية واتجاه كل لوحة 96 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المكتبات ختمها في درجة حرارة الغرفة (17-25 درجة مئوية) بين عشية وضحاها أو حتى المستعمرات مرئية لا أساس لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة شطف مع الماء المقطر حتى يتم إزالة جميع آثار المستعمرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الكونغو الأحمر (CR ؛ 0.5 ٪ في الماء) على لوحة غسلها. تأكد من إضافة ما يكفي لتغطية CR اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تتجاوز 15 دقائق للحضانة CR. وسوف أوقات أطول في الحضانة نتيجة هالات أقل وضوحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي CR وإضافة كمية سخية (أكثر من كافية لتغطية لوحة) من كلوريد الصوديوم 1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي كلوريد الصوديوم للكشف عن تدهور هالات CMC. لأفضل حل للهالات ، قد تكون هناك حاجة أوقات أطول مع حضانة يغسل كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم أو متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المسواك العقيمة ، واختيار الانزيمات النشطة من الحيوانات المستنسخة لوحة رئيسية لمزيد من توصيف. </li></ol> 3. ممثل النتائج : ويرد مثال على هذه الشاشة لقراءة إنتاجية عالية في الشكل 3. يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة ونشط نشاطا ضعيفا ، ونشطة للغاية تستند على حجم المناطق التدهور. هذا مفيد خصوصا إذا تم تضمين انزيم يعرف من النشاط في المكتبة كمرجع. كما هو موضح هنا ، وتحديد من الانزيمات النشطة قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك ، نرجو أن تدرك أن وضع العلامات الكافية لوحات الفحص مهم للغاية. يجب على الباحث أن يكون قادرا على تحديد المتغيرات النشطة ، بعد غسل المستعمرات بعيدا ، من أجل اعتقالهما من لوحة رئيسية في تخزين -80 درجة مئوية لتوصيف آخر. وأخيرا ، فإنه من الصعب تقييم مسبق للعلاقة بين الأنشطة على ركائز الاصطناعي مقابل الطبيعية. لذا ، يجب على الباحث اختبار جميع الحيوانات المستنسخة إيجابي على المواد ذات الصلة صناعيا لتحديد اللياقة البدنية البروتين. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="الشكل 1"> الشكل 1. مخطط تخطيطي لإجراء الفحص. يتم تحويل الخلايا التي تحتوي على مكتبة endoglucanase ومطلي بشكل انتقائي للمستعمرات واحد. استنساخ التقطت ونمت بين عشية وضحاها في لوحات 96 بئر عميقة جيدا ل(1) التخزين في -80 درجة مئوية و (2) طبق الطلاء على لوحات تحتوي على اللجنة العسكرية المركزية وIPTG للحث على التعبير endoglucanase. يتم انتقاؤها من الحيوانات المستنسخة نشطة لوحة رئيسية في تخزين -80 درجة مئوية. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="الشكل 2"> الشكل 2. الاستنساخ والتعبير من المجالات الحفاز الفطرية في E. القولونية. (A) Endoglucanase ناقلات التعبير. وكانت الجينات المستنسخة في pET22b (+) (Novagen) تحت سيطرة المروج T7. (ب) لوحة من اليمين : endoglucanase ، معربا عن BL21 (DE3) المستعمرات. اللوحة اليسرى : هالات تدهور CMC بعد الغسيل والتنمية مع الأحمر الكونغو. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="الشكل 3"> الشكل 3. نتائج عينة من شاشة الأحمر CMC / الكونغو. الصور التي التقطت لوحات الفحص بعد الغسيل والكونغو التنمية الأحمر. جميع المستعمرات في لياليوكانت لوحات creening مشابهة من حيث الحجم.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تحديد سرعة سريعة وعالية من الأنزيمات نشطة ، مع الحد الأدنى من التلاعب. الكشف عن نشاط حساس جدا ، ويعكس نوعيا كمية النشاط داخل الخلية. سهولة استخدامه يجعل هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من المكتبات الانزيم ، وقلة فقط من التعبير الوظيفي في E. القولونية. علاوة على ذلك ، لا يقتصر الفحص نشاط من هذا النوع لالسليلوزات الفطرية ، ولكن يمكن تكييفها لendoglucanase أي نشاط أو أي نشاط سلولاز التي توجد ركيزة للذوبان (مثل CMC).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> عدد المنتجات </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> سيغما </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> الكونغو الأحمر </td><td> سيغما </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethyl السليلوز </td><td> سيغما </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto أجار </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> لوحات الأحيائي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

ارتفاع المناولة فحص النشاط endoglucanase الفطرية في القولونية</em

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

الانزيمات سلولاز (endoglucanases ، cellobiohydrolases وglucosidases β) يتحلل السيليلوز إلى سكريات عنصر ، والتي بدورها يمكن تحويلها إلى وقود الكحول 1. كثفت احتمالات الإنزيمية من الكتلة الحيوية السليلوزية لتوفير الطاقة المتجددة الجهود الرامية إلى مهندس السليلوزات اقتصادية لإنتاج وقود 2. ذات أهمية خاصة هي السليلوزات 3-8 الفطرية ، والتي هي بالفعل قيد الاستخدام الصناعي للأغذية وتجهيز المنسوجات. تحديد المتغيرات النشطة بين مكتبة السليلوزات متحولة أمر بالغ الأهمية في عملية الهندسة ، ويمكن اختبار المزيد من المسوخ نشطة لتحسين خصائص و / أو تعرضوا لالطفرات إضافية. وقد أعاق الهندسة كفاءة السليلوزات الفطرية بسبب نقص الأدوات الوراثية للكائنات الحية المحلية والصعوبات في التعبير عن الانزيمات في يستضيف مغاير. في الآونة الأخيرة ، وضعت موريكاوا وزملاء العمل وسيلة للتعبير في E. القولونية المجالات الحفاز endoglucanases من jecorina H. 3،9 ، وهو فطر الصناعية المهمة التي لديها القدرة على إفراز السليلوزات بكميات كبيرة. وظيفية E. كما تم الإبلاغ عن التعبير القولونية السليلوزات من الفطريات الأخرى ، بما في ذلك Macrophomina phaseolina 10 و Phanerochaete ذهبية الأبواغ 11-12. نقدم طريقة لفحص إنتاجية عالية من النشاط endoglucanase الفطرية في E. القولونية. (الشكل رقم 1) يستخدم هذا الأسلوب المشترك الميكروبية صبغ أحمر الكونغو (CR) لتصور تدهور الأنزيمية من السليلوز carboxymethyl (CMC) التي تنمو على الخلايا المتوسطة الصلبة. ويتطلب فحص النشاط الكواشف غير مكلفة ، والتلاعب الحد الأدنى ، ويعطي نتائج لا لبس فيها كمناطق التدهور (&quot;هالات&quot;) في موقع مستعمرة. على الرغم من عدم تدبير كمية من النشاط الأنزيمي يحددها هذا الأسلوب ، وجدنا أن حجم الهالة يرتبط النشاط الأنزيمي الكلي في الخلية. وتوصيف مزيد من الحيوانات المستنسخة إيجابية تحديد الفرد ، نسبة البروتين للياقة البدنية. البكتيرية كله نشاط الخلية المقايسات التقليدية CMC / 13 CR تنطوي صب CMC آغار تحتوي على المستعمرات ، والتي هي عرضة للتلوث العرضي ، أو الثقافات تفرخ في الآبار آغار اللجنة العسكرية المركزية ، التي هي أقل قابلية لتجارب على نطاق واسع. نحن هنا التقرير تحسن وضع بروتوكول بتعديل أساليب غسل القائمة 14 لنشاط سلولاز : تتم إزالة الخلايا المزروعة في أطباق أجار CMC قبل CR تلطيخ. بروتوكول لدينا يقلل بشكل ملحوظ عبر تلوث وتدرجية عالية ، والسماح للفحص السريع للآلاف من الحيوانات المستنسخة. بالإضافة إلى H. الانزيمات jecorina ، أعربنا عن وفرزهم من المتغيرات endoglucanase aurantiacus Thermoascus والبنسليوم decumbens (كما هو موضح في الشكل 2) ، مما يوحي بأن هذا البروتوكول تنطبق على انزيمات من مجموعة من الكائنات الحية.

وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية في<em&gt; E. القولونية.</em&gt; الأسلوب يعتمد على قراءات بصرية بسيطة من تدهور الركيزة ، لا يتطلب تنقية الإنزيم ، وتدرجية عالية. وهذا يسمح للفحص السريع للمكتبات واسعة من المتغيرات الانزيم.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

تعمل إنزيمات السيليولاز (الإندوجلوكانازات، والسيلوبيوهيدرولازات، وبيتا-جلوكوزيدازات) على تحلل السليلوز مائياً إلى سكريات مكونة، والتي يمكن بدورها تحويلها ...

في عملية الفحص عالية الإنتاجية هذه لنشاط إنزيم الإندو-غلوكوناز الفطري في بكتيريا e coli، يُستخدم صبغ الكونغو الأحمر (Congo Red) الميكروبي الشائع لتصور التحلل الإنزيمي لـ carboxy methyl cellulose بواسطة الخلايا النامية على وسط صلب؛ حيث يتم أولاً تحويل الخلايا باستخدام مكتبة من إنزيم الإندو-غلوكوناز وزراعتها بشكل انتقائي للحصول على مستعمرات مفردة. بعد ذلك، يتم اختيار النسائل الفردية وزراعتها طوال الليل في أطباق ذات 96 بئراً. تالياً، يتم إجراء فحص إنزيمي عن طريق الزراعة التكرارية على أطباق CMC تحتوي على IPTG لتحفيز تعبير إنزيم الإندو-غلوكوناز.وأخيراً، يتم اختيار المستعمرات النسلية من اللوحة الرئيسية المخزنة عند -80 درجة Celsius. يعطي هذا المقايسة نتائج غير غامضة تظهر على شكل مناطق تحلل في موقع المستعمرة، حيث يتناسب حجم الهالة مع النشاط الإنزيمي، مما يسمح بالتقييم النوعي للياقة البروتينية النسبية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل طريقة التغطية (overlay method)، في أنها تتيح إجراء تحليل عالي الإنتاجية مع معدل منخفض جداً من الإيجابيات الكاذبة.أضف 25 جرامًا من وسط نمو LB، و15 جرامًا من الآجار، و1.5 جرامًا من ركيزة كربوكسي ميثيل السليلوز إلى لتر واحد من الماء المقطر، ثم استخدم الجهاز المعقام (autoclave) للتعقيم. بعد أن يبرد الوسط، أضف المضادات الحيوية المناسبة وIPTG بتركيز نهائي قدره 100 micromolar. صُب الآن 200 ملليلتر من الوسط في كل طبق من خمسة أطباق بتري مربعة كبيرة أو صواني مقايسة حيوية، واترك الأطباق حتى تجف تمامًا.أولاً، قم بإنشاء مكتبة من النطاقات التحفيزية لإنزيم endo gluconate في ناقل مناسب مثل PET 22 B plus من شركة Novagen. أولاً، قم بإنشاء مكتبة من النطاقات التحفيزية لإنزيم endo gluconate في ناقل مناسب مثل PET 22 B plus من شركة Novagen الذي يحتوي على محفز T7 مع مشغل lac وتسلسل إشارة PAL LV للاستهداف إلى الجبلة (periplasm). قم بتحويل مكتبة endo gluconate إلى سلالة e coli BL 21 DE3 وازرعها في أطباق للحصول على مستعمرات منفردة باستخدام الخرز الزجاجي، ثم حضن عملية التحويل طوال الليل عند 37 °C. باستخدام أعواد أسنان معقمة، قم بتلقيح المستعمرات في أطباق 96.املأ أطباق الآبار العميقة بـ 400 µL من وسط LB المدعم بالمضادات الحيوية المناسبة. يتم التحضين عند 37 °C طوال الليل مع الرج بسرعة 250 RPM. الآن، أضف الجلسرول المعقم إلى مستنبتات الآبار الـ 96 التي حُضنت طوال الليل، وذلك بغرض التخزين طويل الأمد عند -80 °C.ستكون هذه هي اللوحة الرئيسية باستخدام طابع مكون من 96 مسماراً، حيث يتم نقل مزارع المبيت إلى ألواح الفحص التي تحتوي على IPTG وCMC لكل لوحة فحص. قم بطباعة خمس مجموعات من مزارع المبيت مع وضع الملصقات المناسبة، ثم يتم تحضينها في درجة حرارة الغرفة حتى تتكون مستعمرات مرئية. استمر في شطف اللوحة بالماء المقطر حتى تتم إزالة جميع آثار المستعمرات.صُب كمية كافية من صبغة الكونغو الحمراء (Congo red) بتركيز 0.5% لتغطية الطبق المغسول، ثم يتم التحضين لمدة أقصاها 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صَفِّ الصبغة ثم صُب كمية وافرة من كلوريد الصوديوم بتركيز 1 مولار، ويُحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تخلص من كلوريد الصوديوم لإظهار هالات تحلل CMC.باستخدام عود أسنان معقم، اختر الإنزيمات النشطة من الطبق الرئيسي لإجراء المزيد من التوصيف. في هذا المثال، تم إنتاج نواقل تعبير endo gluconate في PET 22 B plus تحت تحكم T seven promoter مع lack operator. ثم تم فحص أداء T لمستعمرات BL 21 التي تعبر عن endo gluconate لإنتاج هالات تحلل CMC. بعد الغسل والتحميض باستخدام Congo Red، يمكن عادةً تحديد المستنسخات في أطباق الفحص هذه على أنها غير نشطة، أو ضعيفة النشاط، أو عالية النشاط بناءً على حجم مناطق التحلل.هنا، يعد تحديد الإنزيمات النشطة عملية قوية وقابلة للتكرار. ومن المهم تذكر وضع ملصقات تعريفية صحيحة على أطباق الفحص من أجل تحديد المستنسخات الإيجابية بدقة في الطبق الرئيسي.

high-throughput-screening-fungal-endoglucanase-activity-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا البروتوكول شاشة إنتاجية عالية للنشاط cellulolytic من مكتبة metagenomic أعرب في القولونية. الشاشة هو حل قائم ومؤتمتة للغاية ، ويستخدم واحد في 384 وعاء الكيمياء microplates جيدا مع قراءات النهائي باعتبارها قياس الامتصاصية.

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

المصدر: كيم، ه. وآخرون، الفحص متعدد الإنزيمات باستخدام نظام فحص إنزيمات جينية عالي الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو طريقة فحص جيني للكشف عن تعبير الإنزيمات باستخدام مكتبات فوسميدات ميتاجينومية وركائز كروموجينية. يحدد التدفق الخلوي ويعزل الخلايا المفردة المنتجة منتجات ملونة، مما يتيح اختيار عالي الإنتاجية للخلايا النشطة المعبرة عن الإنزيمات.

الكشف عن تعبير الإنزيم المستهدف في الخلايا البكتيرية المعدلة وراثيا

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم النشط للكربوهيدرات باستخدام ركائز هيدروجيل بوليمر كروموجينيك غير قابلة للذوبان. يحلل الإنزيم هذه الركائز إلى منتج ملون قابل للذوبان يمكن قياسه عن طريق قياس كثافة لون المنتج.

فحص الإنزيم القائم على هيدروجيل البوليمر الكروموجينيك: طريقة إنتاجية عالية لفحص الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات باستخدام ركائز اصطناعية

ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

يعد التعبير المشترك للبروتين &lt; p class = 'jove_content'&gt; بديلا قويا لإعادة تكوين مجمعات البروتين في المختبر ، وهو يساعد في إجراء الاختبارات البيوكيميائية والجينية في الجسم الحي. نبلغ هنا عن استخدام التعبير المشترك للبروتين في الإشريكية القولونية للحصول على مجمعات البروتين ، وضبط تواتر الطفرات في الخلايا.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

يتم وصف مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم. تتكون مجموعة الفحص الجاهزة للاستخدام متعددة الإرسال هذه من ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) المختارة مسبقا وركائز الكتلةB الهرومولينية Cالمعقدة I (ICB). الإنزيمات المستهدفة هي الإنزيمات الداخلية والبروتياز المتحلل للسكاريد.

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

ويصف هذا البروتوكول منهجية الفائق للشاشة وظيفيا للإرث القائم على البروتين في S. cerevisiae.

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

قد تؤثر ميكروبات الأمعاء بشكل إيجابي أو سلبي على صحة مضيفها من خلال آليات محددة أو محفوظة. Caenorhabditis elegans هي منصة ملائمة لفحص مثل هذه الميكروبات. يصف البروتوكول الحالي الفحص عالي الإنتاجية ل 48 عزلة بكتيرية للتأثير على مقاومة إجهاد الديدان الخيطية ، ويستخدم كبديل لصحة الديدان.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

يصف هذا العمل بروتوكولا للشاشة الجينية المثبطة متعددة النسخ في Schizosaccharomyces pombe. تستخدم هذه الشاشة مكتبة بلازميد على نطاق الجينوم لتحديد استنساخ (نسخ) مثبط لنمط ظاهري مفقود الوظيفة مرتبط بسلالة متحولة للاستعلام. تم تحديد مثبطات جينية جديدة للمتحور الفارغ ell1 باستخدام هذه الشاشة.

الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في Schizosaccharomyces pombe

يقدم هذا البروتوكول سير عمل قياسي للفحص عالي الإنتاجية للكائنات الدقيقة الصناعية. يتضمن بناء مكتبة للطفرات عبر الطفرات بتقنية ARTP، وإجراء فحص إيجابي للقطرات باستخدام الميكروفلويديكس الآلي، ثم التحقق من النتائج. تم التحقق من موثوقية سير العمل من خلال فحص سلالات B. coagulans عالية الإنتاجية.

الفحص عالي الإنتاجية للطافرات العصية المثلجة التي تنتج حمض اللاكتيك L-اللاكتيك وتعمل باستخدام منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات

اكتشف طريقة فحص عالية الإنتاجية لنشاط الإندوغلوكاناز الفطري في E. coli باستخدام صبغة Congo Red. تتيح هذه التقنية تقييمًا بصريًا سريعًا للنشاط الإنزيمي دون الحاجة إلى تنقية البروتين.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية

استكشف المزيد من الفيديوهات