Name: مقدمة لتقنية الموجات فوق الصوتية مستهدفة تدمير Microbubble (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: اكتشف تقنية تدمير الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية المستهدفة لتوصيل الجينات العلاجية إلى القلب والكبد. تعمل الطريقة على تعزيز كفاءة التحويل الجيني عبر التكهف الصوتي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد شمل الدعم منحة NHLBI HL080532 ، NHLBI HL073449 ، NCRR RR16453 ، والمنحة الوطنية AHA في جائزة المعونة (لRVS). مدد شكر خاص لتصميم ملعب المسافة والاستشارات (DCDC) المجموعة ، dcdcgroup.org ، لمساعدتها في إنتاج الفيديو ، وإلى وزارة التعليم الأمريكية منحة رقم P336C050047 التي أسست DCDC.

1. Microbubble إعداد المخزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 10 مليليتر من مزيج PBS 200 ملغ 1،2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل كولين و 50 ملغ ، 1،2 dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل إيثانولامين مع الجلوكوز ز 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الخليط في الماء المغلي 20-30 دقيقة حمام ، ماصة خلط كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. </li></ol> 2. إعداد Microbubble <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ ميكرولتر 250 من محلول المخزون microbubble إعداد واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل الحل قبل تحسنت microbubble إلى 1.5 مل microtube يحتوي على 50 ميكرولتر من الجلسرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ملغ من الحمض النووي بلازميد ترميز المنقى تعبير عن بناء هذا الجين من الفائدة (المنقى في هذا المثال من قبل عدة الذيفان الداخلي Qiagen MegaPrep الحرة ، Qiagen ، جيرمانتاون ، دكتوراه في الطب ، مع تركيز الأمثل لل4mg/ml). يضاف 2.4) الفوسفات مخزنة المالحة إلى الحجم النهائي من 500 ميكرولتر. وتستخدم الذيفان الداخلي مجانا maxipreps Qiagen ، فضلا عن برنامج تلفزيوني العقيمة من أجل ضمان العقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم استبدال الهواء في microtube Octafluoropropane بالغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهتز بقوة ثم microtube ملغام في طب الأسنان لمدة 20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ثم المتبقية التي تحتوي على الحمض النووي غمير والعازلة التي لم منضمة إلى microbubbles إزالتها بعناية ، ويتم غسل طبقة microbubble ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة الحمض النووي غير مرتبط ، ووضعها على الجليد بين كل دورة غسيل. نحن عادة ما يحقق الكفاءة الملزمة 30-40 ٪. كل الكواشف ومعقمة ويتم الحرص على تقليل التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع في بلازميد الحمض النووي ملزمة microbubbles على الجليد لمدة تصل إلى ساعتين حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استخدام غمير إزالتها من microtube بعد مزجها ويغسل PBS ، لتحديد تركيز الحمض النووي غير منضم ، وكذلك المبلغ ملزمة تستند إلى تركيز الأولية المعروفة ، عن طريق قياس كثافة بصرية لهذا الحل في طول موجة من 260nm به a معمل. </li></ol> 3. معايرة المعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أول استخدام ، والتجويف ميغاهرتز 1 محول يحتاج إلى معايرة لضمان مؤشر ميكانيكية سليمة وتكرار النبض. تم توصيل submergible 1 ميغاهيرتز ، 13mm ، محول غير مركزة على وظيفة 20 ميغاهرتز / التعسفي مولد الموجي من خلال مكبر للصوت السلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع محول في وعاء من البلاستيك مليئة بالماء ، تهدف بصورة مباشرة في السمع المائي ، الذي تم توصيله إلى 500 ميغاهيرتز الذبذبات عبر مكبر للصوت الاتهام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموجي ، ويمكن جميع الترددات والسعة ، ودورة الاندفاع ، وتضخيم السلطة يمكن تعديلها للحصول على دورة العمل المناسب والأمثل لمؤشر الميكانيكية في التجويف microbubbles. عن هذه التجربة وجه الخصوص ، نحن معايرة نظام لمؤشر الميكانيكية يعادل 1،3 ~ في 1 ميغاهيرتز. </li></ol> 4. Microbubble التسليم وUTMD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التسليم وmicrobubble UTMD ، تم C57BL / 6 تخدير الفئران مع 100mg/kg زيلازين الكيتامين و5mg/kg IP عن طريق الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت تدار عن طريق الوريد Microbubble التسليم عن طريق الحقن المباشر في البطين الأيسر من القلب ، أو من خلال قسطرة الوريد الذيل. لحقن القلب مباشرة ، يتم حقن حجم ما يصل الى 100 ​​ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد microbubble محملة من خلال إبرة قياس 30 المدرجة في المساحة الأمامية ال 4 الوربية تحت التصور بالموجات فوق الصوتية في البطين الأيسر من القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والبلعة حل microbubble الناجمة عن الحقن بين البطينين الأيسر هو تصور باستخدام Visual سياتل '38 ميغاهيرتز الموجات فوق الصوتية عالية التردد محول وضعت في موقف ثابت على الصدر من الماوس في منظور طويل محور باستخدام VisualSonics" VEVO نظام التصوير 2100. جميع المحاقن والإبر المعقمة هي وتأمين أفضل بيئة ممكنة لالعقيمة هذه الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد الحقن ، ويتم التدمير لmicrobubble ~ 5 دقائق باستخدام الثانية ، بحجم أصغر محول التردد المنخفض 1.0 ميغاهيرتز الذي عقد مباشرة على الجهاز المطلوب ، وتستهدف تدمير لهذه المنطقة. في هذا المثال ، كانت تدار من الموجات فوق الصوتية للكبد في نبض تردد تكرار 1.0 ميغاهرتز ، مع ما يعادل مؤشر ميكانيكية ل1،3-1،5 تقريبا ، وفترة تكرار النبضة 100 مللي لكل دورة 20. بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون نبض بوابات لتخطيط القلب من الفأرة (لا يظهر في هذه التجربة) إلى انفجار الإطارات من 3 الموجات فوق الصوتية ، في كل دورة 4-6 القلب. علينا الحصول على قدر أكبر من الكفاءة مع ترنسفكأيشن من البروتوكولات التي تسمح للسرير الشعرية لإعادة ملء مع فقاعات بين رشقات نارية من الموجات فوق الصوتية. </li></ol> 5. البديل أسلوب التسليم اخترنا لتسليط الضوء على الحقن بين البطينين بسبب تعقيد الإجراءات ، ولكن في كثير من الحالات ، مثل التسريب المطول للmicrobubbles ، وريد في الذيلjection هو الأسلوب المفضل. للأسلوب الذيل الوريد microbubble التسليم ، والفأر هو تخدير بنفس الطريقة. تم توصيل حقنة تحتوي على البلازميد الحمض النووي ملزمة microbubbles لقسطرة الوريد إبرة قياس 27 / الذيل. يتم إدخال القسطرة في الوريد الذيل الثالث القاصية من أوردة الأطراف إما إلى اليمين أو اليسار أن طول ذيل الفأر. يتم وضع الحقنة التي تحتوي على microbubbles في مضخة التسريب التي تدير تلقائيا حجم موحد من الحل مسبقا على مدى فترة زمنية محددة مسبقا. نحن عادة ما لبث 200 300μl بمعدل 3ml/hour. استخدام الحيوان وقد تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للممارسات الجيدة الحيوان على النحو الذي حدده الوطنية ذات الصلة و / أو الهيئات المحلية الرفق بالحيوان ، وتمت الموافقة على جميع الحيوانات التي تعمل اللجنة المناسبة (جامعة هاواي رعاية الحيوان المؤسسي ولجنة استخدام ورقم الموافقة 07-100 -3). وقد استخدم التخدير المناسب (الكيتامين / zylazine) والمسكنات (Bupivicaine والبوبرينورفين) كانت متوفرة ، ولكن ليس المطلوب. 6. ممثل النتائج : ويمكن تقييم فعالية التسليم UTMD بوساطة الحمض النووي بلازميد من خلال مجموعة متنوعة من أساليب وهذا يتوقف على الجينات المشفرة في بناء هذا النحو ، ولكن ليس على سبيل الحصر ؛ luciferase المجراة في مجال التصوير ، B - غال تلطيخ فيفو السابقين ، و / أو immunohistology. على وجه الخصوص ، في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي فيفو يسمح احد لرصد وجود ومدتها التعبير الجيني في الفئران transfected متسلسل مع ترميز البلازميد جين مراسل bioluminescent (luciferase). وXenogen وفي فيفو نظام تصوير (IVIS) (الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA) يستخدم لتصوير bioluminescent. وتؤخذ عادة لوحات لجميع الفئران في اليوم الأول بعد ترنسفكأيشن بوساطة UTMD وتتكرر كل ثلاثة او اربعة ايام حتى bioluminescent التعبير الجيني لم يعد يمكن كشفها بصريا من خلال نظام (الشكل 1). للتحضير لتصوير bioluminescent الفئران ، الفئران تتلقى أولا حقن IP لمراسل luciferase التحقيق مد luciferin (الفرجار علوم الحياة) ويتم بعد ذلك تخدير ~ 3 دقائق. يسمح Biodistribution الركيزة D - luciferin المضي قدما لمدة 10 دقائق قبل ~ يوضع الحيوان في غرفة التصوير IVIS وأخذ صورة مسح كامل الجسم. خلال عملية الاستحواذ ، ويتم قياس الفوتونات المنبعثة من luciferase يراعة / D - luciferin تفاعل كيميائي ضوئي. الشكل 1 يوضح أيضا الأنواع IVIS التصوير bioluminescent الكبد UTMD التالية ، والشكل 2 هو epifluorescence (100X) صورة الكبد transfected ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة luciferase الابتدائي (سيغما الدريخ) وAlexFluor - 568 الضد الثانوية مترافق (Invitrogen) . فمن الواضح أن نرى أن تتوسط كبد UTMD ترنسفكأيشن أثرت ليس فقط على خلايا بطانة الأوعية الدموية ، ولكن hepatocyes كذلك. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 UTMD Xenogen / IVIS تصوير القلب الفئران التي عولجت (A) فأرة التحكم السلبية :. البلازميد + PBS تليها الموجهة UTMD القلب ، (B) ماوس العلاج : البلازميد + Microbubbles تليها الموجهة UTMD القلب ، و (ج) معاملة ماوس : توجه UTMD Microbubbles + البلازميد تليها الكبد. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. المناعية من UTMD الكبد (المضادة للluciferase باللون الأحمر) : (أ) مع عدم وجود البلازميد UTMD ، و (B) مع البلازميد UTMD. صورة مبائر (100X) ؛ النوى ودابي الأزرق الملون.

<ol><li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li>
<li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction%3A+a+review+of+non-cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ultraschall+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li>
<li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li>
<li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li>
<li>Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+destruction+of+albumin+microbubbles+directs+gene+delivery+to+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium.</a> Circulation. 101, 2554-2556 (2000).</li>
<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+Compositions%2C+Properties+and+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Sci+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications.</a> Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).</li>
<li>Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+enhances+AAV-mediated+gene+transfection+in+human+RPE+cells+in+vitro+and+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo.</a> Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Newman, C. M., Bettinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+ultrasound+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer.</a> Gene Ther. 14, 465-475 (2007).</li>
<li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction%3A+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

UTMD يمثل نهجا جديدا لتوصيل الجينات. كما يمكن أن تكون منصة تقنية دمجتها مع أي من العديد من الاستراتيجيات المحتملة للعلاج الجيني ، لتقديم عدد لا يحصى من الجزيئات النشطة بيولوجيا عند المطلوب على درجة عالية من الدقة الأنسجة. القيد الرئيسي للتقنية البيولوجية هو انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن. وهناك اعتبار آخر مهم هو سهولة الحصول على الجهاز المستهدف للموجات فوق الصوتية ، والتي يمكن أن تضعف بشكل ملحوظ من خلال التدخل العظم أو الهواء. الأسلوب الأمثل للتقنية ويتطلب بناء على النسيج المستهدف 1...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف / المعدات </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> 1،2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل كولين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 5911 </td><td> مكون من الدهون قذيفة microbubble </td></tr><tr><td> 1،2 - dipalmitoyl - SN - glycero - 3 - فسفاتيديل إيثانولامين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 3275 </td><td> مكون من الدهون قذيفة microbubble </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G5400 </td><td> الفكر لتحقيق الاستقرار في microbubbles </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P5368 </td><td></td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G5516 </td><td> يعتقد لمنع microbubbles من ائتلافه </td></tr><tr><td> Octafluoropropane الغاز </td><td> AirGas </td><td> N / A </td><td> خاملة الغاز المستخدمة في التطبيقات السريرية </td></tr><tr><td> VialMix الأسنان ملغام </td><td> بريستول مايرز سكويب </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 1 ميغاهيرتز ، 13mm ، محول غير مركزة </td><td> اوليمبوس </td><td> A303S - SU </td><td></td></tr><tr><td> 20 ميغاهيرتز وظيفة / التعسفي مولد الموجي </td><td> اجيلنت </td><td> 33220A </td><td></td></tr><tr><td> السلطة مكبر للصوت </td><td> كرون - هايت شركة </td><td> نموذج 7500 </td><td></td></tr><tr><td> مائي </td><td> وBruel كيير </td><td> اكتب 1803 </td><td></td></tr><tr><td> تهمة مكبر للصوت </td><td> وBruel كيير </td><td> اكتب 2634 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ميغاهيرتز راسمة الذبذبات </td><td> LeCroy </td><td> 9354L </td><td></td></tr><tr><td> VisualSonics &quot;VEVO نظام التصوير 2100 مع محول 34 ميغا هرتز </td><td> VisualSonics </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> 27G one الوريد الذيل بوصة القسطرة </td><td> VisualSonics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> المارد بلس مضخة التسريب </td><td> كينت العلمية </td><td> GENIE </td><td></td></tr></tbody></table>

مقدمة لتقنية الموجات فوق الصوتية مستهدفة تدمير microbubble

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

في الجزيئات ، UTMD النشطة بيولوجيا ، مثل الحمض النووي سالبة الشحنة ناقلات البلازميد ترميز الجينات في المصالح ، تضاف إلى قذائف الموجبة من الدهون عوامل التباين microbubble 7-9. في الفئران يمكن أن تدار هذه microbubbles ناقلات تحمل عن طريق الوريد أو مباشرة إلى البطين الأيسر من القلب. ويمكن في جو من الحيوانات أيضا أن تكون عن طريق القسطرة غرست intracoronary. تسليم لاحقة من الدورة الدموية إلى الجهاز المستهدف يحدث من قبل التجويف الصوتية على تردد الرنين لmicrobubbles. يبدو من المرجح أن الطاقة الميكانيكية التي تولدها نتائج الدمار microbubble في تشكيل مسام عابرة أو بين الخلايا البطانية من microvasculature من المنطقة المستهدفة 10. نتيجة لهذا التأثير sonoporation ، هو تعزيز الكفاءة في ترنسفكأيشن وعبر الخلايا البطانية ، وتترسب التحوير ترميز نواقل في الأنسجة المحيطة. DNA البلازميد المتبقية في الدورة الدموية والتي تدهورت بفعل nucleases بسرعة في الدم ، مما يقلل من احتمال مزيد من التسليم لغير sonicated الأنسجة وتؤدي إلى الجهاز ترنسفكأيشن المستهدفة محددة للغاية.

ويمكن استخدام الموجات فوق الصوتية تدمير Microbubble المستهدفة (UTMD) لتوجيه محدد موقع التسليم من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك الجينات العلاجية ، لهدف الوصول إلى أجهزة الموجات فوق الصوتية ، مثل القلب والكبد<sup&gt; 1-6</sup&gt;.

مقدمة لتقنية الموجات فوق الصوتية مستهدفة تدمير Microbubble

في تقنية التوصيل عبر الأغشية باستخدام الحويصلات الدهنية (UTMD)، تُضاف الجزيئات النشطة بيولوجياً، مثل ناقلات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (plasmid DNA) سالبة الشحنة والتي تُشفر جيناً مستهدفاً، إلى القشور الكاتيونية للدهون...

يرمز مصطلح UTMD إلى تدمير الفقاعات الدقيقة الموجه بالموجات فوق الصوتية. ويمكن استخدام تقنية UTMD لتوجيه تسليم الجزيئات النشطة بيولوجياً إلى مواقع محددة، بما في ذلك الجينات العلاجية، لاستهداف الأعضاء التي يمكن الوصول إليها بالموجات فوق الصوتية مثل القلب والكبد. وفي تقنية UTMD، تُضاف الجزيئات النشطة بيولوجياً، مثل ناقلات DNA البلازميدية سالبة الشحنة التي تشفر جيناً مستهدفاً، إلى القشور الموجبة للفقاعات الدقيقة الدهنية المستخدمة كعوامل تباين؛ ومن ثم يمكن إعطاء الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالناقل عن طريق الوريد أو مباشرة في البطين الأيسر للقلب.في الحيوانات الأكبر حجماً، يمكن إيصالها أيضاً بواسطة قسطرة تاجية داخل الشرايين مع أو بدون فترة انتظار. ويحدث الإيصال اللاحق من الدورة الدموية إلى العضو المستهدف بشكل أمثل من خلال التكهف الصوتي عند تردد رنين الفقاعات الدقيقة. ويبدو من المرجح أن الطاقة الميكانيكية الناتجة عن تدمير الفقاعات الدقيقة تؤدي إلى تكوين مسام مؤقتة في أو بين الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في المنطقة المستهدفة.ونتيجة لهذا التأثير، تزداد كفاءة عفن التحويل (transfection) داخل الخلايا البطانية وعبرها، ويمكن ترسيب ناقلات الجينات المشفرة في الأنسجة المحيطة المستهدفة. أما الحمض النووي DNA البلازميدي المتبقي في الدورة الدموية، فيتحلل بسرعة بواسطة النوكلياز في تحضير الفقاعات الدقيقة في الدم. يتم أخذ جزء من محلول مخزون مُحضّر من الفقاعات الدقيقة يحتوي على محلول ملحي منظم بـ glucose phosphate، و diol glycerol three phosphatidylcholine و diol glycerol three.يتم أولاً تحضين الفوسفاتيديل إيثانولامين عند 40 °C لمدة 15 دقيقة. ثم يتم نقل محلول الفقاعات الدقيقة الدافئ إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 mL يحتوي على الجلسرول وما بين 1 و 2 mg من DNA البلازميد المُنقّى الذي يشفر بنية تعبيرية للجين المستهدف. يُضاف المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات حتى يصل الحجم النهائي إلى 500 µL.يتم بعد ذلك استبدال الهواء في الأنبوب الدقيق بغاز Octa fluoro propane. ثم يُرج الأنبوب الدقيق بقوة في جهاز خلط الحشوات السنية (dental amalgamator) لمدة 20 ثانية. معايرة الجهاز قبل الاستخدام الأول: يجب معايرة محول الطاقة للتكهف UTMD بتردد 1 ميجاهرتز لضمان المؤشر الميكانيكي وتكرار النبض المناسبين.يتم توصيل محول طاقة مغمور بتردد 1 MHz بمولد موجات من خلال مضخم قدرة. يوضع محول الطاقة في حاوية بلاستيكية مملوءة بالماء وموجهة مباشرة نحو ميكروفون مائي (hydrophone)، والذي تم توصيله بجهاز أوسيلوسكوب عبر مضخم شحنة. ويمكن تعديل تردد الموجة وسعتها ودورة النبضات وتضخيم القدرة للحصول على دورة تشغيل ومؤشر ميكانيكي مناسبين لتحفيز تكهف الفقاعات الدقيقة. وفي هذا الإعداد، قمنا بمعايرة النظام بحيث يكون المؤشر الميكانيكي مكافئاً لـ 1.3 تقريباً عند توصيل الفقاعات الدقيقة بتردد 1 MHz وUTMD قبل توصيل الفقاعات الدقيقة وU-T-M-D-C 57 BL. يتم تخدير ستة فئران باستخدام 100 mg/kg من الكيتامين و5 mg/kg من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP).يتم إعطاء الفقاعات الدقيقة عن طريق الحقن الوريدي من خلال حقن مباشر في البطين الأيسر للقلب أو عبر قسطرة الوريد الذيلي، وهو ما سيتم توضيحه لاحقاً بالنسبة للحقن القلبي المباشر. يتم حقن حجم يصل إلى 100 µL من محلول الفقاعات الدقيقة المحملة بـ DNA البلازمي باستخدام إبرة مقاس 30 gauge يتم إدخالها في المسافة الوربية الرابعة الأمامية تحت التصور بالموجات فوق الصوتية في البطين الأيسر للقلب. يتم تصوير كتلة محلول الفقاعات الدقيقة الناتجة عن الحقن بين البطينين الأيسرين باستخدام محول طاقة للموجات فوق الصوتية عالي التردد من شركة VisualSonics يوضع في وضع ثابت على صدر الفأر في عرض المحور الطولي.مباشرة بعد الحقن، يتم إجراء تدمير للفقاعات الدقيقة لمدة خمس دقائق تقريباً، باستخدام محول طاقة ثانٍ ذو تردد منخفض وحجم أصغر، وبقدرة 1.0 megahertz، حيث يتم تثبيته مباشرة فوق العضو المستهدف لتوجيه التدمير إلى هذه المنطقة. يتم تسليط الموجات فوق الصوتية على الكبد بتردد تكرار نبضي قدره 1.0 megahertz وبمؤشر ميكانيكي يعادل تقريباً 1.3 إلى 1.5، وفترة تكرار نبضية مدتها 100 milliseconds لكل 20 دورة، أو يمكن ربط النبض بتخطيط كهربية القلب (ECG) للفأر بحيث يتم إطلاق دفقات من ثلاث إطارات من الموجات فوق الصوتية كل أربع إلى ست دورات قلبية. وبالنسبة لطريقة توصيل الفقاعات الدقيقة عبر الوريد الذيلي، يتم تخدير الفأر بنفس الطريقة التي يتم بها حقن المحقنة التي تحتوي على البلازميد.يتم توصيل الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالـ DNA بقسطرة وريد الذيل ذات إبرة قياس 27. تُدخل قسطرة وريد الذيل في الثلث البعيد من الأوردة الجانبية اليمنى أو اليسرى التي تمتد على طول ذيل الفأر. تُوضع المحقنة التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة في مضخة تسريب تقوم بإعطاء حجم محدد وموحد من المحلول تلقائيًا على مدى فترة زمنية محددة مسبقًا.تحليل التلألؤ البيولوجي لـ UTMD، يمكن تقييم فعالية توصيل الحمض النووي الريبوزي النووي (plasma DNA) بوساطة UTMD من خلال مجموعة متنوعة من الطرق اعتماداً على الجينات المشفرة في البنية الجينية. وبشكل خاص، يعد التصوير بالتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي (in vivo) إحدى الطرق التي تتيح لك مراقبة وجود ومدة التعبير الجيني في الفئران التي تم نقل البلازميد المشفر لجين تقرير التلألؤ البيولوجي مثل luciferase إليها.يُستخدم نظام التصوير الحي Enogen للتصوير بالتلألؤ البيولوجي. وعادةً ما يتم التقاط صور لجميع الفئران في اليوم الأول بعد عملية ترانسفكشن (transfection) بوساطة UTMD، وتتكرر هذه العملية كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى لا يعود التعبير الجيني للتلألؤ البيولوجي قابلاً للكشف بصرياً من خلال النظام. ولتحضير الفئران للتصوير بالتلألؤ البيولوجي، تتلقى الفئران أولاً حقنة داخل الصفاق (IP) من مسبار لوسيفيراز Lucifer المبلّغ.يتم بعد ذلك تخدير الفئران. وبعد حوالي ثلاث دقائق، يُترك توزيع الركيزة Lucifer للانتشار الحيوي لمدة 10 دقائق تقريبًا قبل وضع الحيوان أو الحيوانات في غرفة تصوير Xeno Gen وأخذ مسح صوري لكامل الجسم؛ وخلال عملية الاستحواذ، يحدد النظام الفوتونات المنبعثة من التفاعل الكيميائي الضوئي لإنزيم Luciferase.باستخدام نظام Xeno للتصوير الحي، يُستخدم برنامج النظام لقياس وتحديد كمية المنطقة المضيئة المرئية محل الاهتمام.

introduction-to-ultrasound-targeted-microbubble-destruction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

Insonation من microbubbles هو استراتيجية واعدة لاجتثاث الورم في وقت بلغ متوسط ​​القوى خفض الصوتية ، فضلا عن تقديم العلاجات المستهدفة. الغرض من هذه الدراسة هو تطوير استراتيجيات منخفضة الموجات فوق الصوتية واجب دورة ينبض nanocarriers لتعظيم غير الحرارية الاجتثاث والاوعية الدموية الدقيقة تحت الجلد لإيصال حمولة C6 الاورام الدبقية.

الموجات فوق الصوتية على النقيض المستهدفة علاج الاورام الدبقية في الفئران عن طريق تسليم المخدرات جسيمات متناهية الصغر ، إذ تضع وتذرية الاوعية الدموية الدقيقة

Microbubble بوساطة انقطاع الموجات فوق الصوتية وركزت على حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) هي تقنية واعدة لغير الغازية لتقديم الأدوية المستهدفة في...

التصوير بالرنين المغناطيسي موجهة تعطيل حاجز الدم في الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة عبر الجمجمة في نموذج الفئران

يصف هذا الفيديو طريقة لتعطيل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) مؤقتا عن طريق إنشاء فتحات عابرة باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة بوساطة الفقاعات الدقيقة (FUS). يمكن استخدام فتحات BBB المحلية العابرة هذه في النهاية لتوصيل جزيئات الدواء الأكبر حجما مباشرة إلى حمة الدماغ.

التركيز على الموجات فوق الصوتية المستندة إلى الفقاعات الدقيقة بوساطة فتح الحاجز الدموي الدماغي: تقنية لإنشاء فتحات عابرة موضعية في الحاجز الدموي الدماغي للفأر عن طريق Sonoporation

هنا، نقدم بروتوكول لحقن الموجات فوق الصوتية وكلاء microbubble التباين في المعيشة، معزولة في وقت متأخر من الحمل أجنة الفئران المرحلة. تمكن هذه الطريقة دراسة المعلمات نضح والواسمات الجزيئية الأوعية الدموية داخل الجنين باستخدام عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة.

التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

ويمكن استخدام البروتوكول التجريبي المقدم لإجراء قياسات في الوقت الحقيقي لنشاط التجويف في جهاز زراعة الخلايا بهدف تمكين التحقيق في الظروف المطلوبة لنجاح تسليم المخدرات و / أو غيرها من النفث الحيوية.

دراسة العلاج المحسن التجويف

تم اقتراح تقنية سريعة وموثوقة للتحكم في تذبذبات شكل فقاعة صوتية واحدة محاصرة تعتمد على تقنية الالتحام بين فقاعتين. تسمح تذبذبات شكل الفقاعة المستقرة التي يتم التحكم فيها بالتماثل بتحليل تدفق السوائل المتولد بالقرب من واجهة الفقاعة.

تحريض التدفق الدقيق بواسطة تذبذبات الفقاعات غير الكروية في نظام الرفع الصوتي

يصف هذا البروتوكول الإجراءات الجراحية والتقنية التي تمكن التصوير الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي لدماغ القوارض أثناء علاجات الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة المركزة لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ.

في الوقت الحقيقي داخل المجهرية متعددةفوتون لتصور الموجات فوق الصوتية المركزة والعلاجات Microbubble لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ

ويمكن استخدام البروتوكولات المقدمة لتوصيف استجابة الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية المصممة لتطبيقات توصيل الأدوية التي تسببها الموجات فوق الصوتية، بما في ذلك آليات تنشيطها وكذلك من حيث النبع الحيوي. تغطي هذه الورقة مجموعة من تقنيات الفحص المجهري في المختبر وفي الجسم الحي التي أجريت لالتقاط الطول والجداول الزمنية ذات الصلة.

طرق المجهر متعددة الوقت لتوصيف الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية لإطلاق المخدرات التي تسببها الموجات فوق الصوتية

يحدد هذا البروتوكول تصنيع الفقاعات الدقيقة الدهنية وطريقة وضع العلامات الراديوية المتوافقة ذات الفقاعات الدقيقة ذات الوعاء الواحد مع كفاءة وضع العلامات الخالية من التنقية &gt;95٪ والتي تحافظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للفقاعات الدقيقة. هذه الطريقة فعالة عبر تركيبات الفقاعات الدقيقة الدهنية المتنوعة ويمكن تخصيصها لتوليد فقاعات دقيقة مشعة و / أو فلورية.

تصنيع ووضع العلامات على الفقاعات الدقيقة باستخدام أجهزة التتبع الفلورية والمشعة

وقد تم تصميم مفاعل حيوي قادر على الضغط دوري تعريض أنسجة القلب صمام ضغط الظروف الفسيولوجية والمرضية. برنامج يتيح للمستخدمين ابفيو (LabVIEW) للسيطرة على ضغط حجم والسعة والتردد. ويمكن استخدام هذا الجهاز لدراسة mechanobiology من نسيج صمام القلب او خلايا معزولة.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

اكتشف تقنية تدمير الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية المستهدفة لتوصيل الجينات العلاجية إلى القلب والكبد. تعمل الطريقة على تعزيز كفاءة التحويل الجيني عبر التكهف الصوتي.

مقدمة لتقنية الموجات فوق الصوتية مستهدفة تدمير Microbubble

استكشف المزيد من الفيديوهات