مقدمة لتقنية الموجات فوق الصوتية مستهدفة تدمير Microbubble

يرمز مصطلح UTMD إلى تدمير الفقاعات الدقيقة الموجه بالموجات فوق الصوتية. ويمكن استخدام تقنية UTMD لتوجيه تسليم الجزيئات النشطة بيولوجياً إلى مواقع محددة، بما في ذلك الجينات العلاجية، لاستهداف الأعضاء التي يمكن الوصول إليها بالموجات فوق الصوتية مثل القلب والكبد. وفي تقنية UTMD، تُضاف الجزيئات النشطة بيولوجياً، مثل ناقلات DNA البلازميدية سالبة الشحنة التي تشفر جيناً مستهدفاً، إلى القشور الموجبة للفقاعات الدقيقة الدهنية المستخدمة كعوامل تباين؛ ومن ثم يمكن إعطاء الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالناقل عن طريق الوريد أو مباشرة في البطين الأيسر للقلب.

في الحيوانات الأكبر حجماً، يمكن إيصالها أيضاً بواسطة قسطرة تاجية داخل الشرايين مع أو بدون فترة انتظار. ويحدث الإيصال اللاحق من الدورة الدموية إلى العضو المستهدف بشكل أمثل من خلال التكهف الصوتي عند تردد رنين الفقاعات الدقيقة. ويبدو من المرجح أن الطاقة الميكانيكية الناتجة عن تدمير الفقاعات الدقيقة تؤدي إلى تكوين مسام مؤقتة في أو بين الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في المنطقة المستهدفة.

ونتيجة لهذا التأثير، تزداد كفاءة عفن التحويل (transfection) داخل الخلايا البطانية وعبرها، ويمكن ترسيب ناقلات الجينات المشفرة في الأنسجة المحيطة المستهدفة. أما الحمض النووي DNA البلازميدي المتبقي في الدورة الدموية، فيتحلل بسرعة بواسطة النوكلياز في تحضير الفقاعات الدقيقة في الدم. يتم أخذ جزء من محلول مخزون مُحضّر من الفقاعات الدقيقة يحتوي على محلول ملحي منظم بـ glucose phosphate، و diol glycerol three phosphatidylcholine و diol glycerol three.

يتم أولاً تحضين الفوسفاتيديل إيثانولامين عند 40 °C لمدة 15 دقيقة. ثم يتم نقل محلول الفقاعات الدقيقة الدافئ إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 mL يحتوي على الجلسرول وما بين 1 و 2 mg من DNA البلازميد المُنقّى الذي يشفر بنية تعبيرية للجين المستهدف. يُضاف المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات حتى يصل الحجم النهائي إلى 500 µL.

يتم بعد ذلك استبدال الهواء في الأنبوب الدقيق بغاز Octa fluoro propane. ثم يُرج الأنبوب الدقيق بقوة في جهاز خلط الحشوات السنية (dental amalgamator) لمدة 20 ثانية. معايرة الجهاز قبل الاستخدام الأول: يجب معايرة محول الطاقة للتكهف UTMD بتردد 1 ميجاهرتز لضمان المؤشر الميكانيكي وتكرار النبض المناسبين.

يتم توصيل محول طاقة مغمور بتردد 1 MHz بمولد موجات من خلال مضخم قدرة. يوضع محول الطاقة في حاوية بلاستيكية مملوءة بالماء وموجهة مباشرة نحو ميكروفون مائي (hydrophone)، والذي تم توصيله بجهاز أوسيلوسكوب عبر مضخم شحنة. ويمكن تعديل تردد الموجة وسعتها ودورة النبضات وتضخيم القدرة للحصول على دورة تشغيل ومؤشر ميكانيكي مناسبين لتحفيز تكهف الفقاعات الدقيقة. وفي هذا الإعداد، قمنا بمعايرة النظام بحيث يكون المؤشر الميكانيكي مكافئاً لـ 1.3 تقريباً عند توصيل الفقاعات الدقيقة بتردد 1 MHz وUTMD قبل توصيل الفقاعات الدقيقة وU-T-M-D-C 57 BL. يتم تخدير ستة فئران باستخدام 100 mg/kg من الكيتامين و5 mg/kg من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP).

يتم إعطاء الفقاعات الدقيقة عن طريق الحقن الوريدي من خلال حقن مباشر في البطين الأيسر للقلب أو عبر قسطرة الوريد الذيلي، وهو ما سيتم توضيحه لاحقاً بالنسبة للحقن القلبي المباشر. يتم حقن حجم يصل إلى 100 µL من محلول الفقاعات الدقيقة المحملة بـ DNA البلازمي باستخدام إبرة مقاس 30 gauge يتم إدخالها في المسافة الوربية الرابعة الأمامية تحت التصور بالموجات فوق الصوتية في البطين الأيسر للقلب. يتم تصوير كتلة محلول الفقاعات الدقيقة الناتجة عن الحقن بين البطينين الأيسرين باستخدام محول طاقة للموجات فوق الصوتية عالي التردد من شركة VisualSonics يوضع في وضع ثابت على صدر الفأر في عرض المحور الطولي.

مباشرة بعد الحقن، يتم إجراء تدمير للفقاعات الدقيقة لمدة خمس دقائق تقريباً، باستخدام محول طاقة ثانٍ ذو تردد منخفض وحجم أصغر، وبقدرة 1.0 megahertz، حيث يتم تثبيته مباشرة فوق العضو المستهدف لتوجيه التدمير إلى هذه المنطقة. يتم تسليط الموجات فوق الصوتية على الكبد بتردد تكرار نبضي قدره 1.0 megahertz وبمؤشر ميكانيكي يعادل تقريباً 1.3 إلى 1.5، وفترة تكرار نبضية مدتها 100 milliseconds لكل 20 دورة، أو يمكن ربط النبض بتخطيط كهربية القلب (ECG) للفأر بحيث يتم إطلاق دفقات من ثلاث إطارات من الموجات فوق الصوتية كل أربع إلى ست دورات قلبية. وبالنسبة لطريقة توصيل الفقاعات الدقيقة عبر الوريد الذيلي، يتم تخدير الفأر بنفس الطريقة التي يتم بها حقن المحقنة التي تحتوي على البلازميد.

يتم توصيل الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالـ DNA بقسطرة وريد الذيل ذات إبرة قياس 27. تُدخل قسطرة وريد الذيل في الثلث البعيد من الأوردة الجانبية اليمنى أو اليسرى التي تمتد على طول ذيل الفأر. تُوضع المحقنة التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة في مضخة تسريب تقوم بإعطاء حجم محدد وموحد من المحلول تلقائيًا على مدى فترة زمنية محددة مسبقًا.

تحليل التلألؤ البيولوجي لـ UTMD، يمكن تقييم فعالية توصيل الحمض النووي الريبوزي النووي (plasma DNA) بوساطة UTMD من خلال مجموعة متنوعة من الطرق اعتماداً على الجينات المشفرة في البنية الجينية. وبشكل خاص، يعد التصوير بالتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي (in vivo) إحدى الطرق التي تتيح لك مراقبة وجود ومدة التعبير الجيني في الفئران التي تم نقل البلازميد المشفر لجين تقرير التلألؤ البيولوجي مثل luciferase إليها.

يُستخدم نظام التصوير الحي Enogen للتصوير بالتلألؤ البيولوجي. وعادةً ما يتم التقاط صور لجميع الفئران في اليوم الأول بعد عملية ترانسفكشن (transfection) بوساطة UTMD، وتتكرر هذه العملية كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى لا يعود التعبير الجيني للتلألؤ البيولوجي قابلاً للكشف بصرياً من خلال النظام. ولتحضير الفئران للتصوير بالتلألؤ البيولوجي، تتلقى الفئران أولاً حقنة داخل الصفاق (IP) من مسبار لوسيفيراز Lucifer المبلّغ.

يتم بعد ذلك تخدير الفئران. وبعد حوالي ثلاث دقائق، يُترك توزيع الركيزة Lucifer للانتشار الحيوي لمدة 10 دقائق تقريبًا قبل وضع الحيوان أو الحيوانات في غرفة تصوير Xeno Gen وأخذ مسح صوري لكامل الجسم؛ وخلال عملية الاستحواذ، يحدد النظام الفوتونات المنبعثة من التفاعل الكيميائي الضوئي لإنزيم Luciferase.

باستخدام نظام Xeno للتصوير الحي، يُستخدم برنامج النظام لقياس وتحديد كمية المنطقة المضيئة المرئية محل الاهتمام.