استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

توضح هذه الطريقة كيف يمكن للجمع بين التثقيب الكهربائي في الجسم الحي (in vivo)، المنفصل زمنياً ومكانياً، مع السلالات المعدلة وراثياً من سمك الزيبرا، استهداف مناطق محددة من الجنين النامي للتعبير عن الجين المنقول. ابدأ باستخدام أربعة أسماك معدلة وراثياً من نوع cal TA تم اشتقاقها بطريقة مصيدة المعزز (enhancer trap) لتقييد التعبير الجيني وأنواع الخلايا المستهدفة. في هذه الحالة، يكون الهدف هو البصلة الشمية النامية في وقت محدد من التطور؛ قم بحقن بلازميد GFP المراسل في الطرف الأمامي للدماغ الأمامي في الجسم الحي، ثم قم بإجراء التثقيب الكهربائي لتسهيل إيصال الحمض النووي DNA. تشير النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير الفلوري في الجسم الحي إلى التموضع الدقيق للجين المنقول في وقت وعملية محددة من التطور.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل حقن البلازميد في مرحلة الخلية الواحدة في أن التعبير الجيني يكون مستهدفاً لأنواع خلوية محددة ضمن منطقة معينة من الدماغ النامي. استخدم السلالة المعدلة وراثياً من سمك الزيبرا (zebrafish) التي تم إنشاؤها عبر طريقة مصيدة المعزز (enhancer trap) لتحفيز التعبير عن كل من عامل النسخ calt A four والبروتين المراسل M cherry في مناطق محددة من الدماغ النامي. قم بإجراء تزاوج بين أسماك بالغة متغايرة الزيجوت للإدراج المعدل وراثياً مع أسماك من النوع البري لإنتاج ذرية معدلة وراثياً بنسبة 50% تقريباً.

الآن، يتم معالجة الأجنة المعدلة وراثياً بـ 100 micromolar من phenyl threa، بدءاً من ست إلى ثماني ساعات بعد الإخصاب لحجب تكوين الصبغة وتسهيل التصوير الفلوري عند 24 إلى 28 ساعة بعد الإخصاب، ثم تُنقل الأجنة إلى ماء البيض بدون PTU، وتحت المجهر الفلوري، يتم تحديد الأجنة المعدلة وراثياً من خلال تعبير M cherry في microwave. يتم تحضير محلول بتركيز 0.5% من low melting point aros في محلول electroporation buffer مضافاً إليه trica، ثم يتم موازنة المحلول.

في حاضنة مضبوطة عند درجة حرارة 34 إلى 37 درجة Celsius، ضع قطرة كبيرة، حوالي 500 µL من محلول agro في مركز طبق بتري بقطر 60 مليمتر. باستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة الغشاء الكوريوني من الأجنة المعدلة وراثياً. انقل الأجنة المحررة إلى طبق بتري يحتوي على محلول تخزين التثقيب الكهربائي مضافاً إليه 0.02% من مخدّر trica لمدة دقيقتين.

الآن، انقل ستة إلى ثمانية أجنة مخدرة إلى قطرة الـ aros المُحضرة باستخدام رؤوس ماصات Michael loader مقصوصة. ضع الأجنة بحيث تكون جميعها متجهة في الاتجاه نفسه ومصطفة في صف عمودي. ثبت الأجنة في مواقعها عن طريق تجميد الـ aros باستخدام طبق بتري كبير يحتوي على 2-3 mm من الثلج.

املأ الطبق بمحلول electroporation buffer مضافاً إليه trica، مع التأكد من أن المحلول يغطي قطرة aros المتصلبة بالكامل. قم بتحضير بلازميد تعبير GFP المنقى مع صبغة phenol red للحقن. الآن، قم بتصنيع ماصات الحقن المجهري باستخدام رأس ماصة micro loader.

أضف من 1 إلى 2 µL من محلول DNA البلازميد إلى ماصة الحقن، ثم قم بتركيب وتثبيت ماصة التحميل في حامل الماصات الخاص بنظام الحقن بالضغط. قم بتحرير الضغط العكسي في الماصة المحملة عن طريق إدخالها بسرعة عبر منديل Kim wipe مغمور حتى تنتج نبضات الضغط تحرراً تدفقياً (POF) لمحلول DNA الأحمر مع توجيه الماصة نحو النهاية الأمامية للدماغ النامي. احقن محلول DNA البلازميد في بطينات الدماغ النامي باستخدام الحقن بالضغط.

يتم دفع الحمض النووي DNA ليكون مجاوراً للبصلة الشمية المرتقبة. يتم حقن الـ DNA حتى يصبح الصبغ الأحمر مرئياً بوضوح عند الطرف الأمامي لبطين الدماغ الأمامي. انتقِل فوراً إلى خطوة التثقيب الكهربائي لمنع انتشار الـ DNA وتخفيف تركيزه.

اضبط جهاز التحفيز SD nine لإنتاج نبضات تخريم كهربائي مفردة مدتها 5 millisecond وبجهد 70 volts. ضع الأقطاب الكهربائية بحيث يكون القطب الموجب مجاوراً للنهاية الداخلية للجنين، بينما يكون القطب السالب خلف رأس الجنين.

قم بتفعيل ثماني نبضات تثقيب كهربائي يدويًا باستخدام مفتاح تحفيز واحد في جهاز التحفيز SD nine، مع الفصل بين كل نبضة وأخرى بفاصل زمني قدره ثانية واحدة. اترك الأجنة لتتعافى لمدة 10 دقائق على الأقل.

الآن وباستخدام ملقط دقيق، تتبع برفق الخطوط الخارجية للأجنة مع تجنب التلامس الفعلي مع الأجنة نفسها. ثم قم بتحرير الأجنة من هلام الأجار. أعِد الأجنة إلى ماء البيض، واحفظها في درجة حرارة 28 درجة مئوية حتى يتم تحليل التعبير عن GFP.

انقل الأجنة إلى ماء البيض مضافاً إليه مخدر trica بنسبة 0.02% لعدة دقائق كما سبق، ولكن في مركز طبق بتري أصغر بقطر 35 مليمتر. أضف قطرة كبيرة من محلول aros بنسبة 0.5% منخفض درجة الانصهار مع ماء البيض وtrica. الآن، أضف جنيناً واحداً مخدراً إلى هذه القطرة من aros باستخدام رؤوس ماصات micro loader مقصوصة.

ضع الجنين في وضع عمودي لتسهيل الرؤية الظهرية للدماغ النامي تحت مجهر قائم. قم بتجميد الـ aros على الثلج واستخدم رؤوس تحميل دقيقة مقصوصة للحفاظ على توجيه الجنين. أخيرًا، اغمر الطبق بماء البيض مضافًا إليه trica مع التأكد من أن المحلول يغطي قطرة aro المتصلبة تمامًا.

يجمع هذا المثال بين الدقة الزمنية للتثقيب الكهربائي في الجسم الحي (in vivo electroporation) والتعبير النوعي للخلايا بوساطة خطوط تحويلية من مصيدة المعزز (enhancer trap transgenic lines) لاستهداف البصلة الشمية النامية. يظهر خط مصيدة المعزز التحويلي تعبيراً تأسيسياً لبروتينات m cherry وcalt A four في الدماغ الخلفي والمخيخ، وfour brainin والبصلة الشمية في الأجنة بعد خمسة أيام من الإخصاب. ومن الأهمية بمكان أنه بعد أربعة أيام من التثقيب الكهربائي، تظهر الخلايا التي تعبر عن GFP بروزات محورية نموذجية للخلايا المترالية في البصلة الشمية.

تُظهر هذه المقارنة بين إشارات M Cherry والتعريض الضوئي المنخفض لـ GFP أن أجسام الخلايا التي تعبر عن GFP متمركزة بالفعل في البصيلة الشمية باستخدام بنيات RNA ذات دبوس الشعر القصير. ويمكن استخدام هذا الإجراء أيضاً لاستحثاث فقدان الوظيفة في أنواع محددة من خلايا الدماغ النامي.