التحقيق الخارجي على الحركة خلية الشعر مع مزيج من التحفيز الخارجي المتردد مجال كهربائي عالي السرعة وتحليل الصور

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم طريقة موثوقة لاستقصاء الاستجابات الحركية للخلايا الشعرية الخارجية (OHC)، بما في ذلك الحركية الكهربائية، والحركية البطيئة، والانحناء عند الترددات الصوتية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال استئصال العظام الصدغية من خنازير غينيا، أو الفئران، أو حيوانات ثديية أخرى، وفتح البثرة لعرض القوقعة. وتتمثل الخطوة الثانية في غمر القوقعة في وسط Lebovits L 15، مع إزالة المنطقة القمية من القشرة العظمية، والرباط الحلزوني، وقناة فاس (straw of vais)، وإزالة عضو كورتي.

بعد تحضين عضو كورت لمدة خمس دقائق في كولاجيناز بتركيز 1 mg/mL، يتم نقله إلى غرفة التسجيل باستخدام حقنة هاميلتون بسعة 50 µL، وتُفصل الخلايا عن طريق تدويرها عبر الإبرة. ثم تُنقل غرفة التسجيل إلى المجهر لتحفيز الخلايا باستخدام مجال كهربائي خارجي متردد، وتسجيل الاستجابات الحركية للخلايا الشعرية الخارجية المعزولة بواسطة كاميرا عالية السرعة. وفي النهاية، يمكن تقييم الخلايا الشعرية الخارجية، والخلية، والحركية الكهربائية، والحركية البطيئة، والانحناء عند الترددات الصوتية من خلال تحليل الصور بمساعدة الكمبيوتر.

ابدأ هذا الإجراء باستخراج العظام الصدغية من خنازير غينيا، أو الفئران، أو نماذج حيوانية ثديية أخرى. ثم افتح العظام الصدغية باستخدام قصافة دقيقة. ومن أجل كشف القوقعة، أزل العظم الزائد بعناية مع الحفاظ على القشرة العظمية للقوقعة سليمة، ثم اغمرها في وسط livi L 15.

تحت المجهر، افتح المنطقة القمية للقوقعة. قم بإزالة الغشاء السمعي، والـ VASIs، والرباط الحلزوني باستخدام طرف شفرة المشرط، أو ملقط دقيق، أو ملقط رفيع. قم بإزالة عضو كورتي من الموديس القوقعي باستخدام الملقط.

ضع القوقعة بعد ذلك في محلول collagenase بتركيز 1 mg/mL في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إذا كانت هناك حاجة للخلايا الشعرية من الالتفافات القاعدية للقوقعة، فقم بإزالة القشرة العظمية التي تغطي قاعدة القوقعة باستخدام الملقط، وافصل الحلزون عن العظم الصدغي باستخدام شفرة المشرط. وقبل إزالة عضو كورتي، انقل عضو كورتي إلى غرفة التسجيل باستخدام سرنجة Hamilton سعة 50 µL. ثم قم بفصل الخلايا عن طريق دفعها ذهاباً وإياباً عبر الإبرة.

إليك مخطط لمولد المجال الكهربائي المتردد الخارجي والروابط مع نظام التقاط الصور، ودوائر التحكم، والبرمجيات التي تم تنفيذها خصيصاً في المركز الهندسي لمعهد House Ear Institute. يتكون الإعداد التجريبي المستخدم في هذه التجربة من مجهر مقلوب من طراز Axia vert 1 3 5 TV مع نظام إضاءة بديل يعتمد على LED وجهازي تلاعب دقيق إلكترونيين. يوجد ثلاث تقارير كاميرا على المجهر، وهي كاميرا photron فائقة السرعة يتم التحكم فيها بواسطة جهاز كمبيوتر، وكاميرا fast cam X 10 24 PCI في وحدة teleport، والتي تتميز بدقة عالية وتلتقط الصور بترددات عالية تصل إلى 100,000 FPS.

يتم رصد الصور التي توفرها الكاميرا عالية السرعة مباشرة على شاشة الكمبيوتر. كما يتم توصيل كاميرا CCD عادية إضافية في المنفذ العيني بشاشة عالية الدقة. وتسمح كاميرا تصوير رقمية تقليدية في المنفذ الأمامي بالتقاط إطارات ثابتة، بينما يقوم برنامج مُصمم محلياً يعمل على نفس الكمبيوتر بالتحكم في مشغل الكاميرا عالية السرعة، ونظام الإضاءة، وحامل المجال الكهربائي المتردد الخارجي.

يتكون القطبان من سلكين من الفضة بقطر 0.25 millimeter مع مسافة بين الطرفين تبلغ 0.8 millimeters على جهاز تلاعب دقيق كهربائي. بعد ذلك، يتم معايرة المجال الكهربائي باستخدام قطب خارجي؛ حيث يقوم هذا القطب بقياس الجهد الكهربائي في نقاط مختلفة لإنشاء خريطة للمجال الكهربائي.

إذا وُضعت خلية شعر خارجية واحدة معزولة بين طرفي القطبين بحيث يكون محورها الطولي موازياً للمجال الكهربائي المتردد المطبق، فإنها تتحرك بالتمدد والتقلص بنفس تردد المجال الكهربائي. على سبيل المثال، تظهر هنا خلية يتم تحفيزها بتردد 50 hertz ويتم تسجيلها بمعدل 1000 إطار في الثانية. وتظهر الصورة التالية خلية يتم تحفيزها بتردد أربعة kilohertz ويتم تسجيلها بمعدل 18,000 إطار في الثانية.

إذا وُضعت الخلية بشكل عمودي على المجال، يمكن ملاحظة ودراسة نوع مختلف من استجابة انحناء الخلايا الشعرية الخارجية. فهذه الخلية، على سبيل المثال، تنحني عند تحفيزها بتردد 50 hertz باستخدام مجال كهربائي عمودي على محورها الطولي. ويمكن للخلايا الشعرية الخارجية أن تظهر تغيرات في الشكل استجابةً للتحفيز غير الكهربائي.

تُسمى هذه الاستجابة ببطء الحركة، ويمكن استقصاؤها أيضاً باستخدام هذه التقنية. اختر تحفيزات مختلفة من بين البروتوكولات الأربعة المختلفة؛ حيث يكون البروتوكول الأول عبارة عن تردد واحد مستمر.

لاحظ أنه يمكن اختيار وضع التحفيز، والتردد، والسعة، ونوع الموجة، والتي يشار إليها بدوائر حمراء عبر برنامج التحكم المصنع محلياً. بروتوكول التحفيز الثاني هو التردد المفرد النبضي (bursted single frequency)، حيث يمكن ضبط طول النبضات والفترات الفاصلة بينها. أما البروتوكول الثالث فهو المسح الخطي (linear sweep)، والذي يمكن فيه ضبط الترددات الابتدائية والنهائية.

بروتوكول التحفيز الرابع هو التحفيز المتعدد، والذي يسمح بالجمع بين أنماط تحفيز مختلفة. بعد اختيار المعلمات المقابلة، يقوم برنامج التحكم بتهيئة النظام ويسمح للمشغل ببدء تسجيل الفيديو المتزامن مع الضوء وتحفيز الخلايا من خلال النقر على زر واحد في شاشة الكمبيوتر. في هذا المقطع، تظهر الخلايا الشعرية الخارجية المعزولة تغيرات في الطول أو الانحناء عند تحفيزها بمجال كهربائي متردد خارجي يكون موازيًا أو مستعرضًا، على التوالي، لمحورها الطولي.

يتم تحليل استجابات الخلايا الشعرية الخارجية دون اتصال بالإنترنت باستخدام وظيفة تتبع الميزات في برنامج pro analysts؛ يظهر هنا خلية شعرية خارجية يتم تحفيزها بتردد 50 hertz وتسجيلها بمعدل 1000 إطار في الثانية. يوفر البرنامج المسافة بين نقطتين إطاراً تلو الآخر كما هو موضح هنا أثناء تقصر الخلية. تكون المسافة بين النقاط المحددة عند القمة والمشار إليها باللون الأحمر كـ cuticular plate، وقاعدة الخلية المشار إليها باللون الأخضر كـ basal pole، أصغر وتزداد مع استطالة الخلية؛ حيث يقوم البرنامج بتحليل إطار بإطار للتغيرات في طول الخلية الشعرية الخارجية.

توضح اللوحة الموجودة أسفل الصورة أثر الحركة. في هذا المثال، يبلغ إجمالي الطول المتغير حوالي 6.5 بكسل. وهذا مثال يوضح إمكانية اكتشاف حافة الخلية وقياس مساحة المقطع البصري تلقائيًا بواسطة وظيفة تتبع الكنتور باستخدام برنامج pro analys.

في هذه التجربة، تُضاف الكريات المجهرية من البوليسترين إلى محلول الحمام بشكل عشوائي وتلتصق بإحكام بالغشاء البلازمي. يمكن اختيار كريات مجهرية مختلفة في وقت واحد، ويمكن للبرنامج تتبع جميع هذه الكريات تلقائياً إطاراً تلو الآخر. وبهذه الطريقة، يمكن تقسيم الخلايا إلى أقسام، وتقييم حركية كل قسم بشكل مستقل.

من خلال تحديد الكرات الدقيقة الموجودة على الحواف الجانبية للخلية، يمكن تقييم التغيرات في طول كل قطعة والتغيرات في زاوية قطعة واحدة بالنسبة للأخرى بشكل مستقل. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

بالطبع، يلزم توفير وقت إضافي للتحليل غير المتصل بالإنترنت لمقاطع الفيديو المسجلة. ومع ذلك، باستخدام برنامج مناسب، يمكن إتمام هذا التحليل في غضون ثلاث ساعات إضافية تقريباً لكل مقطع فيديو. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استقصاء استجابات الخلايا الشعرية الخارجية المتحركة، بما في ذلك الحركية الكهربائية، والحركية البطيئة، والانحناء عند الترددات الصوتية.