قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج مستويات متجانسة من خلايا الكبد البشرية لدراسة بيولوجيا الكبد البشري في المختبر. يبدأ ذلك عن طريق دفع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية الجذعية البشرية إلى الأديم الباطن النهائي باستخدام المحفزات الفسيولوجية النشطة في A و WINT ثلاثة A.As الخطوة الثانية يتم دفع الأديم الباطن النهائي بكفاءة عالية إلى الأديم الباطن الكبدي. بعد ذلك ، ينضج الأديم الباطن الكبدي المشتق من ESC البشري في المختبر لإنتاج خلايا كبد بشرية وظيفية.

تشير نتائج نشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل الغربي ، والتألق المناعي ، وإليزا ، والتمثيل الغذائي للأدوية إلى أن هذه الطريقة تستمد خلايا الكبد من الخلايا الكبدية البشرية بكفاءة حوالي 90٪ باستخدام هذه التقنية ، يمكننا ، من الناحية النظرية ، توليد إمدادات لا تنضب من خلايا الكبد البشرية الأولية ، والتي تظهر مستويات ملحوظة من وظائف الكبد البشري. في المستقبل ، سيفيد هذا التنبؤ الدقيق بسمية الأدوية ويوفر دعما للكبد البشري. الحيلة هي دفع التمايز الشمسي والكثافة الأساسية للخلايا البشرية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن كثافة الخلايا الأساسية ضرورية لتوليد خلايا متجانسة. لقد قمنا بتدريب أكثر من 15 فردا في أربعة مواقع دوليا لأداء هذه التقنية بنجاح. ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتكاثر على صفائح مطلية بماتريجيل مع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، الوسائط المكيفة ORM cm المكملة ب FGF الأساسي.

من المهم توصيف الخلايا الجذعية الجذعية البشرية التي تم الحفاظ عليها قبل التمايز الكبدي بعناية. على سبيل المثال ، تظهر هذه الخلايا مورفولوجيا ESC البشرية. كما أنها تعبر عن علامات الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، OCT four و nano في مستويات مماثلة للتحكم الإيجابي H seven خط ESC البشري.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن ESCs البشرية إيجابية ل SS EEA four. عندما تصل المركبات الكراسينية الكراسية البشرية إلى 30 إلى 60٪ من الطلاقة المشتركة ، استبدل ME CM بوسط تمايز معد حديثا. لبدء التمايز الكبدي ، يجب استبدال الوسط كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام.

بعد ثلاثة أيام ، تأخذ الخلايا مظهرا مثلثا حيث تبدأ في التمايز نحو النمط الظاهري للأديم الباطن. قم بتبديل الوسيط إلى تمايز SR DMSO. ثقافة متوسطة لمدة أربعة إلى خمسة أيام.

استبدال الوسيط كل 48 ساعة. بعد فترة الخمسة أيام هذه ، ستبدأ الخلايا في اكتساب مظهر متعدد الأضلاع مميز للخلايا الكبدية. ينعكس تمايز ESC البشري إلى الأديم الباطن الكبدي في سلسلة من التغيرات المورفولوجية العميقة بحلول اليوم التاسع.

علاوة على ذلك ، يتناقص التعبير عن ثماني أربعة على مدار الدورة الزمنية لمدة تسعة أيام تدريجيا. في المقابل ، تزداد نصوص الكبد من FP والألبومين من اليوم السابع فصاعدا. استمر في نضوج الخلايا والحفاظ على النمط الظاهري الكبدي في الوسط النهائي لمدة تسعة أيام مع وسط جديد كل 48 ساعة.

أخيرا ، راقب الخلايا المستنبتة عن طريق الفحص المجهري على تباين الطور للتغيرات المورفولوجية التدريجية من شكل مثلث شائك إلى مورفولوجيا الكبد المميزة التي تعرض مظهرا متعدد الأضلاع لتقييم مقايسة وظيفة الأديم الباطن الكبدي كميا. بالنسبة للسيتوكروم P أربعة 50 نشاط إنزيمي ، على وجه التحديد SIP ثلاثة A أربعة أو SIP واحد A اثنان. اليوم الأول للاحتضان 17.

خلايا الأديم الباطن الكبدي المشتقة من ESC البشرية مع الركيزة المحددة التي تؤدي تفاعلات في ثلاث نسخ. تذكر استخدام وسائط زراعة الأنسجة كعنصر تحكم سلبي حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. اجمع المواد الطفية وقم بقياس المستويات النسبية للنشاط الأنزيمي القاعدي كما هو مفصل في تعليمات الشركة المصنعة.

الآن ، لكل عينة ، احسب النشاط الأنزيمي لكل ملليغرام من البروتين كما هو محدد بواسطة A-B-C-A-S. تلطيخ مناعي للثقافات النموذجية المشتقة من هذه الطريقة من النضج المختبري للأديم الباطن الكبدي. إظهار التعبير المتجانس لثلاث علامات كبد بشرية ، ألبومين و FP و ein.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بكفاءة بين الخلايا الجذعية البشرية والتعلم إلى خلايا الكبد. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية على أساس يومي مع التزام بحوالي دقيقتين ونصف لكل مليون خلية. من المهم جدا التحقق من التغيرات المورفولوجية على أساس يومي أثناء عملية التمايز.