$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تخضع
الميتوكوندريا ، العضيات السيتوبلازمية المعروفة باسم قوى الخلية ، لتغييرات هيكلية ووظيفية جذرية أثناء تطور السرطان.
لعزل الميتوكوندريا ، خذ أنسجة سرطانية نظيفة في طبق زجاجي وفرمها إلى قطع صغيرة. انقل القطع إلى أنبوب يحتوي على عازلة عزل الميتوكوندريا. تجانس العينة لتعطيل الخلايا وإطلاق محتوياتها ، بما في ذلك العضيات.
الطرد المركزي الخليط بسرعة منخفضة. هذا يكوير المكونات الأكثر كثافة مثل النوى وبقايا الأنسجة وأي خلايا سليمة ، تاركا مكونات أقل كثافة مثل الميتوكوندريا والميكروسومات والبيروكسيسومات والليزوسومات في المادة الطافية. اجمع المادة الطافية وأجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية. تبقى الميكروسومات ، كونها أخف نسبيا ، في المادة الطافية ، بينما يدور الجزء الخام المحتوي على الميتوكوندريا في الأسفل.
قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في وسط تدرج الكثافة المناسب. قم بإعداد تدرج كثافة متقطع عن طريق وضع طبقات من جزء الميتوكوندريا الخام داخل وسائط كثافة مختلفة ، وترتيبها بترتيب تناقص الكثافة من الأسفل إلى الأعلى. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية جدا. تنفصل العضيات داخل الأنبوب لتبني وضع توازن بناء على كثافتها النسبية. اجمع جزء الميتوكوندريا المتكون في الواجهة بين وسائط الكثافة ، والتي تحتوي على البيروكسيسومات والليزوزومات.
لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد 250 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع ما يقرب من 1.5 جرام من أنسجة سرطان المبيض في طبق زجاجي نظيف. أضف 2 مل من عازل الميتوكوندريا المبرد مسبقا لغسل الدم برفق من سطح الأنسجة. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات.
بعد ذلك ، استخدم مقص عيون نظيف لفرم الأنسجة بالكامل إلى قطع يبلغ حجمها حوالي ملليمتر مكعب واحد ونقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 13.5 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا التي تحتوي على ناجارس بتركيز 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر. استخدم الخالط الكهربائي لتجانس الأنسجة المفرومة لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
بعد ذلك ، أضف 3 ملليلتر أخرى من عازلة عزل الميتوكوندريا إلى متجانسات الأنسجة واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. جهاز طرد مركزي تتجانس الأنسجة المحضرة عند 1,300 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الحبيبات واحتفظ بالمادة الطافية.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للطافية عند 10,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على الميكروسوم واحتفظ بالحبيبات. أضف 2 مل من عازلة عزل الميتوكوندريا وأعد تعليق الحبيبات جيدا عن طريق سحب العينة الخفيف.
جهاز الطرد المركزي هذا المعلق الحبيبات عند 7,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات التي تحتوي على الميتوكوندريا الخام. أضف 12 مل من وسط التدرج الكثافة بنسبة 25٪ لإعادة تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة. قم بعمل تدرج كثافة متقطع يحتوي على الميتوكوندريا الخام المعلقة ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، وقم بطردها عند 52,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة.
استخدم حقنة طويلة وغير حادة لجمع الميتوكوندريا المنقاة عند الواجهة بين الوسائط المتدرجة 25٪ و 30٪ ونقلها إلى أنبوب نظيف. أضف المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا إلى الميتوكوندريا المجمعة لتخفيفها إلى حجم ثلاثة أضعاف. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات. اجمع الحبيبات النهائية ، التي تحتوي على الميتوكوندريا النقية ، وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.