اختبار Agarose Spin Down: تقنية لتضمين العضيات للتحليل النسيجي

تلخص الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية العديد من السمات الفيزيولوجية المرضية للسرطانات البشرية. وبالتالي ، تشكل هذه الثقافات في المختبر نموذجا ممتازا لأبحاث السرطان.

لمعالجة هذه العضيات ، ابدأ بثقافة العضيات ثلاثية الأبعاد مسبقة التشكيل المزروعة في مصفوفة غشاء القاعدية المناسبة. أضف وسيط استعادة الخلية المطلوب واحتضانه. يسهل الوسيط إزالة بلمرة هلام المصفوفة ، وإطلاق العضيات ثلاثية الأبعاد في المحلول.

الطرد المركزي هذا الخليط لتكوير العضيات. تظل وسائط الاسترداد التي تحتوي على مكونات المصفوفة في المادة الطافية. تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف محلول بارافورمالدهيد إلى الحبيبات العضوية. تدخل المادة الكيميائية إلى الخلايا العضوية وترتبط بالأحماض الأمينية ، مما يتسبب في تشابك البروتين وتثبيت العينة. هذه الخطوة حيوية لأي تطبيقات نسيجية نهائية.

قم بتكوير العضيات لفصل وإزالة المادة المطفية المحتوية على بارافورمالدهايد. أضف الاغاروز الدافئ المذاب إلى العضيات. استخدم إبرة لفصل وتفريق العضيات المحببة في الاغاروز السائل. اسمح للأغروز بتصلب وتضمين العضيات. استخدم سدادة الاغاروز المحتوية على العضوية للمقايسات النسيجية النهائية.

لمعالجة العضيات لعلم الأنسجة ، قم بإزالة الوسائط الموجودة من البئر مع الحرص على عدم شفط قباب الغشاء القاعدي. أضف حجما متساويا من محلول استعادة الخلايا واحتضن اللوحة لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

بعد الحضانة ، قم بإزاحة قبة الغشاء القاعدي باستخدام ماصة وسحقها بطرف الماصة. اجمع القبة المنفصلة ومحلول استعادة الخلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية واتركها جانبا.

احتفظ بكل المادة الطافية حتى الخطوة الأخيرة عند تأكيد وجود العضيات. أضف الحجم المطلوب من PBS البارد وقم بسحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل لإخراج الحبيبات ميكانيكيا دون تعطيل العضيات. كرر الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية.

ثبت الحبيبات بحجم متطابق من 4٪ PFA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، كرر خطوة الطرد المركزي وغسل PBS. بعد ذلك ، أضف ببطء 200 ميكرولتر من الاغاروز الدافئ بنسبة 2٪ وافصل حبيبات الخلية على الفور ولكن برفق عن جدار الأنبوب دون تعطيلها باستخدام إبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 1 ملليلتر.

بالنسبة لطريقة تدوير الاغاروز ، من الأهمية بمكان فصل حبيبات الخلية عن جدار الأنبوب مباشرة بعد إضافة الاغاروز باستخدام إبرة قياس 25.

بمجرد أن يتجمد الاغاروز تماما ، افصله عن الأنبوب بإبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 1 مليلتر وانقله إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. املأ الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول واستمر في البروتوكول التقليدي لتجفيف الأنسجة وتضمين البارافين.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.