استخراج محللات البروتين: تقنية لتحلل العضيات لجمع البروتينات الخلوية

يجد تحلل الخلية ، أو السائل الذي يحتوي على محتويات الخلايا المحللة ، تطبيقا في العمليات النهائية مثل استخراج البروتين وتحليله. تكشف دراسة هذه الكسور عن معلومات حول خصائص ووظائف الخلايا.

لتحضير محللات البروتين العضوي ، ابدأ بثقافة العضيات المزروعة في مصفوفة غشاء القاعدية المرغوبة. قم بإزالة وسائط الثقافة المستهلكة من الطبق. أضف وسائط دافئة تحتوي على البروتياز فوق المصفوفة. Pipet مرارا وتكرارا لإخراج المصفوفة من الطبق.

احتضان الخليط. تعمل الإنزيمات المحللة للبروتين في الوسائط على تحلل المصفوفة وتطلق العضيات في المحلول. الطرد المركزي للعينة لفصل العضيات عن المادة الطافية المحتوية على الإنزيم.

أعد تعليق الحبيبات العضوية في مخزن مؤقت مناسب لتحلل البروتين. احتضان العينة. تعطل المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت أغشية خلايا العضيات ، وتطلق محتويات داخل الخلايا في المحلول. في الوقت نفسه ، تعمل مثبطات البروتين في المخزن المؤقت على تعطيل أي إنزيمات بروتاز وفوسفاتيز تم إطلاقها ، مما يمنع تدهور بروتينات الركيزة.

علاوة على ذلك ، صوتنة الخليط لتعطيل الخلايا تماما. يتمزق الغلاف النووي ويطلق البروتينات النووية في المحلول. تقوم الموجات الصوتية أيضا بقص الأحماض النووية المنبعثة ، مما يمنعها من تلويث محللات البروتين.

لجمع العضيات ، قم بتفجير هلام المصفوفة بشكل متكرر عن طريق سحب 1 مليلتر من الوسائط المحتوية على التباعد الدافئة مسبقا مباشرة على حلقة هلام المصفوفة حتى يتم إزاحة الحلقة بأكملها. انقل الخليط العضوي من هلام المصفوفة المخلوع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. بعد الهضم الكامل ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف المحلول الملحي المخزن بالفوسفات إلى الحبيبات العضوية وأعد تعليقه عن طريق النقر برفق.

قم بتكسير العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة. أعد تعليق الكريات العضوية في 100 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين لكل 10 ميكرولتر من حجم الخلية المعبأة. انقر فوق التمرير للتعليق. الآن ، صوتنة العضيات عن طريق غمر الأنابيب في الجليد الرطب وتطبيق طرف المزيل الصوتي برفق على السطح الخارجي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق. صوتي لمدة 40 ثانية عند 20 كيلو هرتز قبل الشروع في النشاف الغربي باستخدام البروتوكولات المعمول بها.