التصوير المناعي الكامل: تقنية التثبيت والتلوين لتقييم العضيات السليمة

تشكل عضيات البروستاتا في المقام الأول طبقة خارجية من الخلايا الظهارية القاعدية والطبقات الداخلية للخلايا الظهارية اللمعية مرتبة حول تجويف مركزي.

يسمح التصوير الكامل بدراسة العضيات ثلاثية الأبعاد السليمة مع الحفاظ على مورفولوجيتها وعدم تجانسها. لبدء التلوين ، عالج العضيات بمثبت مناسب لقفل مكوناتها الخلوية في مكانها ، وبالتالي الحفاظ عليها. اغسل العينة لإزالة المثبتات الزائدة.

احتضن بمزيج من محلول الحجب وصبغة تلطيخ الحمض النووي. ترتبط البروتينات الموجودة في محلول الانسداد بشكل سلبي بمواقع غير محددة من الخلايا وتقلل من أي تلطيخ في الخلفية. في الوقت نفسه ، تلطخ صبغة الحمض النووي نوى الخلايا.

أضف مجموعتين من الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف مستضدات معينة تعبر عنها مجموعات الخلايا المكونة. احتضان باثنين من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنت التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. اغسل العينة لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة.

اغمر العضيات الملطخة بالتتابع في تركيزات متزايدة من محاليل السكر المحتوية على الفاعل بالسطح لتحسين شفافية الأنسجة دون المساس بالبنية العضوية. يعزز هذا العلاج عمق تصوير العينة.

قم بتركيب العضيات على شريحة مجهرية تحمل فواصل للحفاظ على مورفولوجيتها ثلاثية الأبعاد أثناء التصوير. استخدم مجهرا متحد البؤر لمراقبة انبعاثات التألق من مجموعات الخلايا القاعدية واللمعية المرتبة حول التجويف المركزي.

لإجراء تلطيخ التألق المناعي الكامل لعضيات البروستاتا ، أضف أولا 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS. احتضان العضيات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد غسل الحبيبات كما هو موضح في بروتوكول النص, أضف 1 ميكروغرام لكل مليلتر من صبغة DAPI في محلول مانع واحتضان لمدة 2 ساعات في درجة حرارة الغرفة. حماية العينة من الضوء أثناء الحضانة من هذه الخطوة إلى الأمام. بعد الطرد المركزي للعضيات كما كان من قبل ، أضف الجسم المضاد الأساسي ومحلول الحجب واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.

حبيبات العضيات مرة أخرى وغسل الحبيبات مع 1 ملليلتر من PBS لمدة 15 دقيقة مع رج لطيف. كرر إجراء الغسيل هذا مرتين. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي والمحلول المانع واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف. بعد الحضانة ، قم بتكسير العضيات واغسل الحبيبات مرتين إضافيتين. أضف 1 مليلتر من 30٪ سكروز في PBS مع 1٪ Triton X-100 إلى العضيات المحببة. ثم ، احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف.

بعد تكوير العضيات مرة أخرى ، أضف 1 مليلتر من 45٪ سكروز في PBS مع 1٪ Triton X-100 ورجها برفق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر الإجراء باستثناء إضافة 1 مليلتر من 60٪ سكروز في PBS مع 1٪ Triton X-100. قم بتحبيير العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة 95٪ من المادة الطافية. راقب الحبيبات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتأكد من أنها لم تضيع أثناء إزالة المادة الطافية. تصبح الحبيبات أكثر مرونة مع ارتفاع تركيز السكروز. انقل 10 إلى 20 ميكرولترا من التعليق المتبقي إلى غطاء غرفة وانتقل إلى الفحص المجهري متحد البؤر.