تحريض الالتهام الذاتي القائم على ADI في خلايا سرطان البروستاتا: تقنية قائمة على الإنزيم لقياس استجابة البلعم الذاتي في الخلايا

الالتهام الذاتي هو عملية داخل الخلايا تسهل تدهور المكونات والعضيات السيتوبلازمية غير المرغوب فيها داخل مقصورات هضمية متخصصة تسمى الجسيمات الحالة. لتقييم الالتهام الذاتي ، ابدأ بثقافة ملتصقة لخلايا سرطان البروستاتا التي تعبر عن بروتينات علامة البلاعمة الذاتية المسماة LC3 مقترنة ببروتينات الفلورسنت الخضراء.

بطبيعتها ، تفتقر خلايا سرطان البروستاتا إلى إنزيم أرجينينوسوكسينات سينسيز الضروري لتخليق الأحماض الأمينية الأرجينين. ولذلك فإن هذه الخلايا تعتمد على مكملات الأرجينين الخارجية من خلال الوسائط للبقاء على قيد الحياة والانتشار.

بعد ذلك ، عالج الخلايا بالأرجينين ديميناز أو ADI. يعمل ADI على تحلل الأرجينين الحر في وسائل الإعلام ، مما يؤدي إلى استنفاد الأرجينين. نتيجة لذلك ، تخضع الخلايا للإجهاد الأيضي ، مما يؤدي إلى استجابة ذاتية البعمية داخليا. في الوقت نفسه ، عالج الخلايا بصبغة فلورية حمراء تصنف الجسيمات الحالة داخل الخلايا.

أثناء الالتهام الذاتي ، تتجمع الهياكل الغشائية على شكل كوب والتي تسمى البلعمة حول المكونات السيتوبلازمية التالفة. في النهاية ، يقومون بتوسيع حمولتهم وإغلاقها أثناء الاقتران مع بروتينات علامة البلاعم الذاتية LC3 لتشكيل حويصلات مزدوجة الغشاء أو البلعمة الذاتية. توفر بروتينات LC3 أيضا علامات فلورية للبلعمة الذاتية. ثم تندمج الحويصلات مع الجسيمات الحالة لتشكيل الجسيمات التحللية الذاتية. تعمل البروتياز الليزوزومي داخل الجسيمات الذاتية على تحلل المكونات الخلوية المبتلعة.

في الوقت الفعلي ، لاحظ التألق الساطع من الجسيمات الذاتية والليزوزومات لتحديد توزيعها داخل الخلايا.

للبدء ، قم بزراعة خلايا سرطان البروستاتا البشرية التي تعبر عن سلسلة الضوء 3 المقترنة بالبروتين الفلوري الأخضر على أطباق ثقافة القاع الزجاجي المطلي بالبولي دي ليسين مقاس 35 ملم ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

يجب طلاء الخلايا بكثافة كافية لتسهيل التكاثر السريع ، ولكن ليس لدرجة أن الخلايا تتضخم وتتجمع بحلول وقت التصوير. عالج عينات الخلايا المختارة بالديميناز الأرجينين ، أو ADI ، في PBS لاستنفاد خلايا الأرجينين الحر والحث على الإجهاد الأيضي في الخلايا السرطانية.

قبل ساعة واحدة تقريبا من التصوير ، قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من LysoTracker Red مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية. قم بإعداد المحاليل باستخدام ADI للعينات المختارة التي تمت معالجتها.

بعد تسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية ، أضف الوسائط المناسبة لكل طبق ثقافة. احتضان الخلايا باستخدام RPMI الذي يحتوي على LysoTracker Red لمدة 15 إلى 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

قبل التصوير بحوالي 30 دقيقة ، قم بتشغيل العلبة البيئية لمحطة الطقس واسمح بالتوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اغسل الخلايا ب PBS واستبدل الوسائط ب RPMI القياسي الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية فقط.

أضف ADI إلى العينات كما هو موضح. قم بتركيب أطباق ثقافة ذات قاع زجاجي مقاس 35 ملم في محول مخصص. استخدم زيت الغاطس على التكبير 60X ، والعدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية 1.42 ، ووضع طبق الثقافة المركب على مرحلة المجهر.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.