تنقية الببتيد: تقنية قائمة على RP-HPLC لاستخراج الببتيدات من محللات البروتين المهضومة

لعزل وتنقية الببتيدات ، ابدأ بتعليق محللات البروتين التي تحتوي على خليط من الببتيدات المهضومة.

عالج الخليط بحمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو كاشف قائم على TFA. يشكل هذا الكاشف الأنيوني أو سالب الشحنة مركبا أيونيا مع بقايا أساسية أو موجبة الشحنة على الببتيدات ، وبالتالي يخفي شحنتها ويحسن مقاومة الببتيد للماء.

الآن ، قم بتجميع كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ذات مرحلة عكسية ، أو RP-HPLC ، تحتوي على طور ثابت مسامي قائم على السيليكا ، مشدود بروابط غير قطبية كارهة للماء. أضف مخزن مؤقت متوافق مع الببتيد إلى العمود لإعداد المرحلة الثابتة قبل تطبيق العينة.

الآن ، قم بتحميل العينة المحمضة في العمود. داخل العمود ، تمتص الببتيدات الكارهة للماء بشكل انتقائي إلى الروابط الكارهة للماء في المرحلة الثابتة. قم بتشغيل مخزن مؤقت للغسيل عبر العمود لإزالة أي جزيئات غير مرتبطة أو غير مرغوب فيها.

بعد ذلك ، قم بتمرير مخزن مؤقت للشطف العضوي أقل قطبية ، مع مقاومة عالية للماء ، عبر العمود. نظرا لتقاربها الانتقائي تجاه المخزن المؤقت للشطف ، فإن الببتيدات المرتبطة تمتص من مصفوفة العمود.

اجمع التصفيط المحتوي على الببتيد من العمود. قم بتجميد التحفيص لإزالة محتوى الماء والحصول على مسحوق جاف من الببتيدات النقية والمستقرة.

لتحمض العينة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 5٪ ، أو TFA ، لكل مليلتر من المحلل. امزج الأنبوب جيدا واستخدم شريط الأس الهيدروجيني لقياس الرقم الهيدروجيني. إذا لزم الأمر ، أضف 5٪ TFA إضافيا لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 2.5. بعد ذلك ، قم بالاتصال بالطرف الأقصر من عمود C18 بمشعب فراغ. بعد ضبط الفراغ بين 17 و 34 كيلو باسكال ، استخدم 3 ملليلتر من الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ وماصة زجاجية لتبليل العمود.

قم بموازنة العمود باستخدام ماصة زجاجية وتطبيق حصتين من 3 ملليلتر بنسبة 0.1٪ TFA. ثم قم بتحميل العينة المحمضة على العمود. استخدم ثلاثة أحجام سعة 3 ملليلتر من 0.1٪ TFA لغسل العمود. بعد ذلك ، قم بتطبيق 2 مل من 40٪ ACN ، 0.1٪ TFA لمسح العينة وجمع جزأين من 2 مليلتر في أنابيب زراعة الزجاج. باستخدام البارافيلم ، قم بتغطية أنابيب الشطف ، واستخدم إبرة قياس 20 لثقب ثلاثة إلى خمسة ثقوب في الغطاء قبل تجميد العينات طوال الليل.

• Trifluoroacetic Acid (TFA) - A strong acid used in protein and peptide purification.
• C18 Column - A stage in HPLC where separation of compounds occurs.
• Acetonitrile (ACN) - A volatile organic compound used in HPLC to elute samples.
• High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) - A technique to separate, identify, and quantify each component in a mixture.
• Peptide - Short chains of amino acid monomers linked by peptide bonds, used in many biological functions.

• HPLC Process - A technique used for separation and measurement of compounds (e.g., peptide).
• Acidification - The method to lower the pH of samples for effective HPLC (e.g., using TFA).
• Column Equilibration - The process of preparing the HPLC column for samples (e.g., wetting the C18 column).
• Elution - The process of extracting a substance from a matrix (e.g., protein from a peptide mixture).

• Peptide Purification - Practical applications in pharmaceuticals and research labs (e.g., peptide).
• HPLC Applications - Broad use in various industries, including biotech, and pharma (e.g., peptide extraction).
• HPLC Societal Impact - Enhancing drug discovery and development processes (e.g., peptide purification).
• HPLC Innovations - Recent advancements improving liquid chromatography technology.