تنقية الببتيد: تقنية قائمة على RP-HPLC لاستخراج الببتيدات من محللات البروتين المهضومة
موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:21 دقيقة • April 30th, 2023
لعزل وتنقية الببتيدات ، ابدأ بتعليق محللات البروتين التي تحتوي على خليط من الببتيدات المهضومة.
عالج الخليط بحمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو كاشف قائم على TFA. يشكل هذا الكاشف الأنيوني أو سالب الشحنة مركبا أيونيا مع بقايا أساسية أو موجبة الشحنة على الببتيدات ، وبالتالي يخفي شحنتها ويحسن مقاومة الببتيد للماء.
الآن ، قم بتجميع كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ذات مرحلة عكسية ، أو RP-HPLC ، تحتوي على طور ثابت مسامي قائم على السيليكا ، مشدود بروابط غير قطبية كارهة للماء. أضف مخزن مؤقت متوافق مع الببتيد إلى العمود لإعداد المرحلة الثابتة قبل تطبيق العينة.
الآن ، قم بتحميل العينة المحمضة في العمود. داخل العمود ، تمتص الببتيدات الكارهة للماء بشكل انتقائي إلى الروابط الكارهة للماء في المرحلة الثابتة. قم بتشغيل مخزن مؤقت للغسيل عبر العمود لإزالة أي جزيئات غير مرتبطة أو غير مرغوب فيها.
بعد ذلك ، قم بتمرير مخزن مؤقت للشطف العضوي أقل قطبية ، مع مقاومة عالية للماء ، عبر العمود. نظرا لتقاربها الانتقائي تجاه المخزن المؤقت للشطف ، فإن الببتيدات المرتبطة تمتص من مصفوفة العمود.
اجمع التصفيط المحتوي على الببتيد من العمود. قم بتجميد التحفيص لإزالة محتوى الماء والحصول على مسحوق جاف من الببتيدات النقية والمستقرة.
لتحمض العينة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 5٪ ، أو TFA ، لكل مليلتر
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية