تخصيب الفوسفوببتيد: تقنية ترسيب مناعي قائم على الأجسام المضادة لفصل الببتيدات الفسفرية المحددة عن مخاليط الببتيد المعقدة

تولد فسفرة بقايا الأحماض الأمينية المحددة ، مثل التيروزين ، الفوسفوربتيدات التي تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم العديد من مسارات الإشارات الخلوية. تسمح دراستها بتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة لعلاج السرطان.

لعزل الفوسفوببتيدات ، ابدأ بمسحوق مجفف بالتجميد من هضم الببتيد المنقى المستخرج من الأنسجة السرطانية. أعد تعليق المسحوق في مخزن مؤقت مناسب لإعداد تعليق ببتيد موحد. حافظ على درجة حموضة محايدة لضمان استقرار الببتيد.

قم بإعداد ملاط يتكون من حبات هيدروجيل مترافقة مع أجسام مضادة محددة مضادة للفوسفوببتيد في المخزن المؤقت المطلوب. أضف ملاط الخرزة إلى تعليق الببتيد. تتعرف الأجسام المضادة المثبتة على الخرزات وترتبط ببقايا الأحماض الأمينية الفسفرية الخاصة بها داخل الفوسفوربتيدات ، وتشكل مجمعات.

الطرد المركزي الخليط لجمع مجمعات حبة الفوسفوببتيد في الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على ببتيدات غير مرتبطة أو فوسفوببتيدات غير محددة. أضف مخزلا مناسبا لشطف الأس الهيدروجيني المنخفض إلى المجمعات واحتضنها. يضعف الرقم الهيدروجيني المنخفض التفاعل بين بقايا الفوسفوببتيد ومجمعات حبات الأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات في المحلول.

انقل الخليط إلى خرطوشة فلتر مجمعة مسبقا. جهاز طرد مركزي لتصفية الفوسفوببتيدات المنبعثة في أنبوب التجميع. قم بتركيز العينة بالتفريغ عند درجة حرارة مرتفعة لإزالة المخزن المؤقت والحصول على حبيبات جافة مركزة من الفوسفوربتيدات النقية.

أعد تعليق المسحوق المجفف بالتجميد مع 0.5 مل من الترسيب المناعي المثلج ، أو IP ، المخزن المؤقت الملزم في كل جزء. انقل حجم إعادة التعليق 0.5 ملليلتر من الكسر الثاني إلى الأنبوب باستخدام الكسر الأول واحفظ طرف الماصة. استخدم 0.5 مل أخرى من المخزن المؤقت IP لشطف كل أنبوب تجفيد قبل نقل المحتويات إلى أنبوب التبريد. ثم كرر الشطف باستخدام 2 مل من المخزن المؤقت IP.

بعد استخدام P200 بطرف مقطوع لنقل مخزون 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من ملاط حبة الأجسام المضادة إلى أنبوب الطرد الدقيق ، أضف 450 ميكرولترا من المخزن المؤقت المرتبط بالإنترنت المثلج لغسل 50 ميكرولترا من ملاط حبة الأجسام المضادة 4G10 و 25 ميكرولترا من ملاط حبة الأجسام المضادة 27B10.4 في أنبوب الطرد الدقيق. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 100 × جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد شفط المادة الطافية ، أضف حجما متساويا مثل الملاط الأصلي للمخزن المؤقت لربط IP لإعادة تعليق الخرز. أضف حبات pY المغسولة مسبقا إلى محلول العينة المعلق في أنابيب التبريد ذات الغطاء اللولبي. ثم احتضنها عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف طوال الليل. بعد تدوير الخرزات ، احفظ المادة الطافية ، والتي سيتم استخدامها لإثراء الببتيدات pST.

بعد ذلك ، استخدم 300 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط IP لإعادة تعليق الخرزات ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر. قم بتدوير العينات عند 100 × جم و 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP ، اغسل الخرزات ثلاث مرات. اغسل الخرزات أربع مرات ب 450 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.5. اغمس طرف تحميل الهلام قليلا تحت سطح الخرزة واستنشق المادة الطافية تماما. أضف أربعة أضعاف حجم الخرزة البالغ 0.1٪ TFA إلى الخرز.

ثم امزجها جيدا واحتضن الأنبوب في خلاط حراري عند 1,000 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. انقل إعادة التعليق إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر ، وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 850 × جم لمدة دقيقة واحدة. بعد نقل الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط بالبروتين ، قم بتركيز المصفاة بالتفريغ على الجفاف عند 40 درجة مئوية مع وقت تسخين 300 دقيقة بين عشية وضحاها.