تخصيب الفوسفوببتيدات القائم على ثاني أكسيد التيتانيوم: طريقة للعزل الانتقائي للفوسفوببتيدات من مكتبة الببتيد

الفوسفوربتيدات عبارة عن سلاسل قصيرة من الأحماض الأمينية تحتوي على بقايا السيرين أو الثريونين أو التيروزين الفسفوري. لعزل الفوسفوببتيدات من مزيج الببتيد ، ابدأ بأخذ حبات ثاني أكسيد التيتانيوم في أنبوب. التوازن لتكييف الخرزات باستخدام مخزن مؤقت ملزم محمض مناسب يحتوي على عامل تبريد. أضف التركيز المطلوب من خليط الببتيد إلى ملاط الخرز.

احتضن الخليط مع الرج المستمر لمنع الخرز من الاستقرار. تعزز الحالة الحمضية مجموعة الفوسفات من الفوسفوربتيدات لتشكيل روابط منسقة مع حبات التيتانيوم. يقلل عامل التبريد الموجود في المخزن المؤقت من أي ارتباط غير محدد للببتيدات غير الفسفرية بالخرز ، مما يتركها في التعليق.

جهاز طرد مركزي لتكوير الخرز المرتبط بالفوسفوربتيد ، بينما تبقى الببتيدات غير الفسفرية في المادة الطافية. تخلص من المادة الطافية. انقل الخرزات المرتبطة بالفوسبوبتيد إلى عمود مرشح الدوران المجمع مسبقا. جهاز طرد مركزي لإزالة المخزن المؤقت الملزم واحتجاز الخرز المترافق بالفوسفوببتيد.

انقل الفلتر إلى أنبوب نظيف وأضف محلولا يحتوي على الأمونيا. تحول الأمونيا التعليق الأساسي ، مما يتسبب في فك ارتباط الفوسفوببتيدات عن الخرز. الطرد المركزي التجميع لتصفية وجمع الفوسفوربتيدات غير المرتبطة. تبقى حبات ثاني أكسيد التيتانيوم في خرطوشة الفلتر. جفف الفوسفوببتيدات لإزالة أي آثار للأمونيا.

قم بتكييف ثاني أكسيد التيتانيوم مسبقا ب 500 ميكرولتر من 100٪ ACN مرتين. بعد ذلك ، قم بتكييف ثاني أكسيد التيتانيوم ب 500 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 M ، الرقم الهيدروجيني 7 ، مرتين. أخيرا ، استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن لغسل الخرزات ثلاث مرات. أضف 400 ميكرولتر من 50٪ ACN ، 0.1٪ TFA إلى أنبوب ربط البروتين المنخفض. ثم أضف 84 ميكرولتر من حمض اللاكتيك.

انقل الفوسفوربتيدات المعلقة إلى أنبوب ربط البروتين المنخفض واحتضانها في درجة حرارة الغرفة باستخدام دوار من طرف إلى طرف لمدة 1 ساعة. بعد تكوير الخرزات ، استخدم 300 ميكرولتر من مخزن التوازن لغسلها مرتين وتدويرها. باستخدام 300 ميكرولتر من مخزن الشطف المؤقت ، اشطف الخرز مرتين. ثم انقلها إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر.

بعد الدوران ، انقل وحدة المرشح إلى أنبوب نظيف منخفض البروتين سعة 1.5 مليلتر ، ومع 200 ميكرولتر من 0.9٪ أمونيوم في الماء ، قم بمسح المحتويات مرتين. بعد فحص درجة الحموضة ، قم بتركيز الشفط بالمكنسة الكهربائية حتى يجف طوال الليل لتبخر الأمونيا.