تحويل ثنائي الكبريتيت للحمض النووي الجيني: طريقة لدراسة مثيلة الحمض النووي في عينات الحمض النووي الجينومي من أنسجة سرطان الجهاز الهضمي

0 مشاهدات4:36 د • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتضمن مثيلة الحمض النووي إضافة مجموعة الميثيل إلى بقايا السيتوزين من الحمض النووي لتكوين ميثيل السيتوزين ، مما يتسبب في تغيير الحمض النووي وتنظيم التعبير الجيني.

لدراسة مثيلة الحمض النووي ، ابدأ بأخذ مستخلص الحمض النووي الخام من الخلايا السرطانية. أضف مخزنا مؤقتا للتخفيف واحتضنه في درجة حرارة الغرفة. يخفف المخزن المؤقت الخليط ويفسد طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة إلى حمض نووي أحادي الشريطة ، مما يفضل إمكانية الوصول إلى القواعد للتفاعلات اللاحقة.

أضف كاشف تحويل واحتضنه في الظلام. يؤدي ثنائي كبريتيت الصوديوم الموجود في الكاشف إلى حدوث كبريتات وإزالة أمينين لاحقا لبقايا السيتوزين غير الميثيلة ، مما يؤدي إلى تكوين اليوراسيل والسلفونات. ومع ذلك ، تظل بقايا السيتوزين الميثيلية دون تغيير.

بعد ذلك ، استكمل الحمض النووي بمخزن مؤقت ملزم ونقله إلى عمود مرشح دوران مجمع مسبقا. يساعد المخزن المؤقت الحمض النووي على الارتباط بالمرشح.

جهاز طرد مركزي لإزالة مزيج كاشف المخزن المؤقت وثنائي الكبريتيت من الحمض النووي المحاصر في العمود. تجاهل التدفق. أضف مخزن مؤقت لإزالة الكبريت القلوي إلى الحمض النووي. يساعد المخزن المؤقت في إزالة مجموعة الكبريتيت من اليوراسيل سلفونات لتكوين اليوراسيل.

جهاز طرد مركزي لإزالة المخزن المؤقت المستهلك. الآن ، أضف مخزن مؤقت للشطف إلى العمود لمسح الحمض النووي المحول. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الحمض النووي. تتضخم جميع بقايا اليوراسيل المحولة على شكل ثايمينات ، بينما تتضخم بقايا السيتوزين الميثيلية على شكل سيتوزينات.

تسلسل بقايا السيتوزين للحمض النووي المضخم لتوليد ملف تعريف مثيلة للعينة.

قم بإجراء علاج البيسلفيت على 45 ميكرولتر من الأنسجة المهضومة باستخدام مجموعة تحويل ثنائي الكبريتيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 5 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتخفيف إلى العينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد كاشف تحويل ثنائي الكبريتيت عن طريق إضافة 750 ميكرولتر من الماء المقطر و 210 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف إلى أنبوب واحد من كاشف تحويل التصوير المقطعي المحوسب. امزج الأنابيب عن طريق الدوامة لمدة 10 دقائق. ثم أضف 100 ميكرولتر من كاشف تحويل التصوير المقطعي المحوسب المحضر إلى كل عينة واخلطها عن طريق الانعكاس.

احتضان العينات في الظلام عند 50 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. بعد الحضانة ، ضع العينات على الجليد لمدة 10 دقائق. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط واخلط كل عينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. قم بتحميل كل عينة في عمود دوران وضع العمود في أنبوب تجميع سعة 2 ملليلتر. الطرد المركزي العينات بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة وتجاهل التدفق من خلال. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل عمود وقم بالدوران بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة ، ثم تخلص من التدفق.

أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة الكبريت إلى كل عمود واترك الأعمدة تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأعمدة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة وتخلص من التدفق من خلال. اغسل العمود مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل ، مع الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة بعد كل غسلة.

أضف 46 ميكرولترا من الماء المقطر إلى كل عمود وضعه في أنبوب بولي بروبلين معقم جديد سعة 1.5 ملليلتر يستخدم مرة واحدة. قم بتدوير الأنابيب لمدة دقيقتين لمسح الحمض النووي والتخلص من العمود. الحمض النووي جاهز الآن للتحليل. استخدم الحمض النووي المعدل للثنائي كبريتيت كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة الكمية لتقييم مثيلة منطقة المحفز في كل تحليل جيني. اجمع بين الكواشف كما هو موضح في المخطوطة النصية ، واستخدم أداة PCR في الوقت الفعلي 96 بئرا لتشغيل بروتوكول التدوير الحراري.

11:19

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي KCNJ10 (Kir4.1)

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

13:21

تحليل شامل للحمض النووي باستخدام طريقة ميثيل-كبغ الملزمة القائمة على الالتقاط في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:18

LINE-1 تحليل الميثيل في الخلايا الجذعية Mesenchymal تعامل مع الحويصلات خارج الخلية المستمدة من العظام

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:34

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

13:11

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

13:18

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

13:47

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:38

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:40

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:11

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 1 أغسطس 2026