عزل العدلات البريتونية منخفضة الكثافة: تقنية للحصول على العدلات منخفضة الكثافة من سائل الغسيل البريتوني باستخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية

العدلات منخفضة الكثافة ، أو LDNs ، هي مجموعة سكانية فرعية مميزة من العدلات توجد بأعداد مرتفعة أثناء الحالات المرضية مثل سرطان الجهاز الهضمي. يمكن عزل LDNs من غسل التجويف البريتوني أو سائل الغسيل للمرضى.

أولا ، قم بتصفية سائل الغسيل لإزالة بقايا الأنسجة. الطرد المركزي للمرشح للحصول على حبيبات تحتوي على خلايا الدم ، بما في ذلك LDNs. أعد تعليقه في مخزن مؤقت مناسب. ضع طبقة من هذا التعليق على وسط تدرج كثافة مناسب مثالي لعزل LDN.

جهاز طرد مركزي لفصل مكونات الدم المختلفة بناء على كثافتها النسبية. تشكل كرات الدم الحمراء الأكثر كثافة الطبقة السفلية ، بينما يشكل جزء البلازما الأقل كثافة الطبقة العليا. تحتل LDNs الأقل كثافة الطبقة الوسيطة جنبا إلى جنب مع الخلايا أحادية النواة الأخرى.

انقل الطبقة الوسيطة إلى أنبوب جديد يحتوي على كاشف مانعب. تمنع مكونات الكاشف مواقع الارتباط غير المحددة على جميع أسطح الخلايا غير المستهدفة وتزيد من خصوصية LDN أثناء وضع العلامات اللاحقة.

أضف الميكروبيدات المترافقة بالأجسام المضادة التي تستهدف جزيئا معينا من سطح الخلية يتم التعبير عنه بشكل مفرط على LDNs. احتضن لمجمعات حبة الأجسام المضادة للارتباط بجزيئاتها المستهدفة على LDNs.

مرر التعليق المحتضن عبر عمود يوضع في مجال مغناطيسي. تحت التأثير المغناطيسي ، تلتصق جميع مجمعات الميكروبيدات LDN بجدار العمود بينما تمر الخلايا غير المسماة.

قم بإزالة العمود. اغسل المحتويات باستخدام مخزن مؤقت مناسب لمسح وتجميع الكسر المحتوي على LDN.

للحصول على العدلات ، أولا ، قم بغرس 1 لتر من المحلول الملحي المعقم العادي مباشرة قبل إغلاق الجرح مباشرة في تجويف البطن لمريض خضع للتو لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة في الجهاز الهضمي ، وغسل تجويف البطن على نطاق واسع لمدة دقيقة واحدة على الأقل. ثم حرك المحلول الملحي داخل التجويف واسترجع 200 مل من سائل الغسيل بأربع محاقن سعة 50 مل.

في المختبر ، انقل سائل الغسيل البريتوني من خلال مرشح نايلون 100 ميكرومتر إلى أنابيب فردية سعة 50 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في 5 ملليلتر من PBS مكملة بنسبة 0.02٪ EDTA وقم بتراكب كل معلق خلية بعناية على 3 ملليلتر من محلول تدرج الكثافة. بعد فصل تدرج الكثافة ، قم بحصاد 2 إلى 3 ملليلتر من الطبقة الوسيطة من كل أنبوب واغسل عينات السائل البريتوني في 10 ملليلتر من PBS الطازج بالإضافة إلى EDTA لكل أنبوب. صب الكريات في 10 ملليلتر من PBS الطازج بالإضافة إلى EDTA لغسل إضافي وتخفيف الخلايا إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل 60 ميكرومتر من فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية ، أو MACS ، تركيز العازلة.

قم بسد أي ربط غير محدد ب 20 ميكرولترا من كتلة Fc لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بإضافة 20 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المضاد ل CD66b. بعد 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، اغسل الخلايا وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وأضف الخلايا إلى عمود مغناطيسي بحجم مناسب داخل المجال المغناطيسي لفاصل مغناطيسي مناسب. عندما تمر جميع الخلايا السالبة CD66b عبر العمود ، أضف 15 مل من المخزن المؤقت MACS الجديد إلى خزان العمود وانقل العمود من الفاصل المغناطيسي إلى أنبوب مخروطي جديد. بعد ذلك ، اغمر العمود على الفور لطرد CD66b الإيجابي المغناطيسي في الأنبوب.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.