تحضير كتلة الإكسوزوم: بروتوكول للحفاظ على الإكسوسومات من خلايا سرطان القولون البشرية المستنبتة

الإكسوسومات هي الهياكل الحويصلية خارج الخلية التي تفرزها الخلايا المستنبتة في المادة الطافية. لتحضير كتلة إكسوسوم ، ابدأ بأخذ مادة طافية تحتوي على الإكسوسوم في أنبوب. الطرد المركزي الأنبوب بسرعة عالية لتكوير الإكسوسومات السليمة. تخلص من المادة الطافية المتبقية.

عالج حبيبات الإكسوسوم باستخدام الجلوتارالديهايد الموجود في المخزن المؤقت للتثبيت. احتضان المزيج على الجليد للوقت المطلوب للحفاظ على مورفولوجيا الإكسوسوم. يتسلل الجلوتارالديهايد إلى الإكسوسومات ويربط البروتينات. يحافظ المخزن المؤقت المثبت على الإكسوسومات عند درجة حموضة محايدة لعملية التثبيت النهائي.

تخلص من المخزن المؤقت المحتوي على الجلوتارالديهايد وأضف محلول رابع أكسيد الأوزميوم - وهو مثبت ثانوي يتخلل طبقة الغشاء الثنائية ويثبت الدهون الموجودة في الإكسوسومات. قم بإزالة محلول رابع أكسيد الأوزميوم ومعالجة الإكسوسومات بسلسلة من التركيزات المتزايدة من الأسيتون. هذه العملية تجفف الإكسوسومات.

استبدل الأسيتون المطلق بخليط الأسيتون المتوسط المضمن. تدريجيا ، قم بزيادة نسبة وسيط التضمين في هذا الخليط.

صب خليط التضمين الذي يحتوي على الإكسوسومات في القوالب المرغوبة. جفف القوالب بالفرن على درجة حرارة عالية. سيؤدي ذلك إلى بلمرة وسط التضمين حول الإكسوسومات ، مما يؤدي إلى ظهور كتل.

لإصلاح حبيبات الإكسوسوم المنقاة ، أضف 1 مليلتر من 2.5٪ جلوتارالديهايد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M عند درجة الحموضة 7.0. احتضان حويصلات ثنائية الطبقة الدهنية لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت واشطف الكريات ب 1 مليلتر من محلول عازلة كاكوديلات الصوديوم 0.1 M في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإصلاح العينات بعد 1 ملليلتر من 2٪ من رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المثبت واشطف حبيبات الإكسوسوم ثلاث مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M ، وقم بتغيير المخزن المؤقت كل 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتجفيف العينة عن طريق رجها لمدة 10 دقائق في سلسلة من تركيزات الأسيتون المتدرجة.

بعد ذلك ، اخلطي محلولا من ثلاثة أجزاء من الأسيتون وجزء واحد من خليط التضمين منخفض اللزوجة. استبدل الأسيتون بهذا الخليط واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة. استمر في زيادة نسبة وسط التضمين منخفض اللزوجة ، مع احتضانه لمدة 30 دقيقة مع كل خطوة.

أخيرا ، قم باحتضان حبيبات الإكسوسوم في 100٪ من خليط التضمين منخفض اللزوجة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتضمين العينة في خليط تضمين نقي منخفض اللزوجة باستخدام قالب تضمين واخبزها لمدة 24 ساعة عند 65 درجة مئوية.