التقطيع والتلوين وتصوير TEM للإكسوسومات المدمجة: بروتوكول لتصور السمات الهيكلية للإكسوسومات باستخدام TEM

الإكسوسومات عبارة عن حويصلات كروية نانوية الحجم محاطة بطبقة ثنائية دهنية تحتوي على الحمض النووي والحمض النووي الريبي وجزيئات البروتين الموجودة داخل التجويف.

لتصور بنية الإكسوسوم باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ، أو TEM ، ابدأ بأخذ كتلة إكسوسوم - كتلة مصفوفة صلبة تحتوي على الإكسوسومات المضمنة. باستخدام ميكروتوم فائق ، احصل على أقسام رفيعة جدا من كتلة الإكسوسوم.

اجمع قسم الإكسوسوم على شبكة مناسبة واتركه يلتصق بالسطح. توفر الشبكة دعما مستقرا لعينة الإكسوسوم لخطوات التلوين اللاحقة.

بعد ذلك ، ضع الشبكة فوق قطرة من أسيتات اليورانيل - بقعة معدنية ثقيلة - واحتضنها للمدة المطلوبة. تتفاعل أيونات اليورانيل مع الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي الموجود في الإكسوسومات.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ قسم الإكسوسوم بسترات الرصاص ، والتي ترتبط أيضا بالجزيئات الحيوية الخارجية. يرتبط سترات الرصاص بشكل ضعيف بأيونات اليورانيل المرتبطة مسبقا ويعزز التباين مع الخلفية أثناء التصوير.

راقب الإكسوسومات الملطخة بشكل مزدوج باستخدام TEM. يركز TEM شعاع الإلكترون على عينة الإكسوسوم. المناطق الملطخة في الإكسوسوم تشتت الإلكترونات بقوة أكبر مقارنة بالمناطق غير الملطخة.

تقوم الفتحة الموضوعية بتصفية هذه الإلكترونات شديدة التشتت. وبالتالي ، فإن الإكسوسومات التي تحتوي على جزيئات حيوية ملطخة تبدو أغمق من الخلفية.

باستخدام ميكروتوم فائق ، قم بإعداد أقسام بسمك 60 نانومتر. ضع الأقسام على شبكة من النيكل وقم بتلطيخ بعضها ب 2٪ من أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة ، متبوعا بسترات الرصاص لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ضع القسم الملون في مجهر إلكتروني ناقل الحركة واعرض العينة باستخدام 80 كيلو فولت واتبع الإعدادات التلقائية لوقت التعرض. مع عرض صورة exosome ، احصل على الصورة واحفظها باستخدام برنامج المجهر.