تلطيخ الذهب المناعي للأقسام الخارجية اللونية: تقنية لتصور العلامات التشخيصية في التجويف الإغراوي

الإكسوسومات عبارة عن حويصلات صغيرة خارج الخلية تحيط بمجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية التي تعمل كمؤشرات حيوية للسرطان.

لتصور المؤشرات الحيوية الخارجية ، ابدأ بأقسام خارجية رقيقة للغاية مدمجة في الراتنج مدعومة على شبكات معدنية مناسبة للفحص المجهري الإلكتروني. احتضان الشبكات في قطرات الجلايسين. يربط الجلايسين ويحييد مجموعات الألدهيد التفاعلية في الأقسام للتغلب على تداخلها مع الفحص.

اشطف العينة بالماء لإزالة الكواشف المتبقية. بعد ذلك ، احتضان العينة في مخزن مؤقت حظر. يحمل المخزن المؤقت بروتينات مصل الدم التي تمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة في العينة.

بعد ذلك ، احتضان العينة في محلول الجسم المضاد الأساسي المطلوب. تتعرف هذه الأجسام المضادة وترتبط بمؤشراتها الحيوية المستهدفة الموضعية في التجويف الخارجي الخارجي. اغسل أي أجسام مضادة غير مرتبطة بمخزن مؤقت مناسب.

الآن ، انقل الشبكات الحاملة للعينات إلى قطرات تحتوي على أجسام مضادة ثانوية مترافقة بالذهب ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. تعمل جزيئات الذهب النانوية كعلامات كثيفة الإلكترون لتصور التوطين الدقيق للجزيئات المستهدفة. اغسل أي أجسام مضادة ثانوية غير مرتبطة بمخزن مؤقت مناسب.

أخيرا ، في ظل الظروف المظلمة ، احتضان الشبكات بالتتابع في محاليل أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص. تعمل كواشف المعادن الثقيلة هذه على تلطيخ وتحسين تباين الجزيئات العضوية مثل الدهون والبروتينات والجليكوجينات في العينة ، مما يميزها عن الخلفية.

راقب الأقسام الملطخة تحت المجهر الإلكتروني الناقل. تظهر المؤشرات الحيوية ذات العلامات الذهبية على شكل جزيئات داكنة داخل تجويف هياكل الإكسوسوم الملطخة بالمعادن الثقيلة.

للبدء ، احتضان شبكات تحتوي على أقسام غير ملوثة بسمك 60 نانومتر في قطرات سعة 50 ميكرولتر من 0.02 متر جلايسين لمدة 10 دقائق لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة. ثم اشطف الأقسام في 100 ميكرولتر من الماء المقطر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد الشطف الأخير ، احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في PBS التي تحتوي على 1٪ BSA. بعد ذلك ، احتضان الشبكات في قطرات من 50 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل KRS لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، اغسل الشبكات خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في قطرة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA. بعد ذلك ، انقل الشبكات إلى قطرة من الجسم المضاد الثانوي المناسب واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. الآن ، اغسل الشبكات خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها بقطرة منفصلة من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA. قم بتلطيخ الأقسام ب 2٪ من أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة في الظلام ، متبوعا بسترات رينولد الرصاص لمدة 10 دقائق. ضع القسم الملون في مجهر إلكتروني ناقل الحركة واعرض العينة باستخدام 80 كيلو فولت وقم بتصويرها باستخدام برنامج المجهر.