موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:10 دقيقة • April 30th, 2023
لإجراء تلطيخ سلبي للإكسوسومات - حويصلات كروية بحجم النانو - ابدأ بأخذ شبكة مجهرية إلكترونية مناسبة. قم بإعداد الشبكة باستخدام مفرغ توهج. هذه العملية تجعل سطح الشبكة محبا للماء لتحسين التصاق العينات.
في الوقت نفسه ، خذ تعليقا من الإكسوسومات المنقاة في أنبوب. استكمل الأنبوب ببارافورمالدهيد - مثبت عينة - واحتضانه. يخترق بارافورمالدهيد الإكسوسومات ويربط البروتينات والأحماض النووية. هذه الخطوة حيوية للحفاظ على مورفولوجيا الإكسوسوم.
الآن ، قم بتحميل تعليق الإكسوسوم على الشبكة المعدة مسبقا واحتضانها للسماح بحدوث الامتزاز. بعد ذلك ، أضف بضع قطرات من أسيتات اليورانيل ، وهي بقعة معدنية ثقيلة ، فوق الشبكة. ترتبط أيونات اليورانيل ببروتينات الغشاء والدهون ، وتشكل رواسب حول حدود الإكسوسوم.
أخيرا ، اغسل الشبكة بالماء لإزالة البقعة الزائدة. اترك الشبكة تجف وتصور باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني أو TEM.
عندما يصطدم شعاع الإلكترون بالإكسوسومات ، فإن البقعة المحيطة بالعينة تشتت المزيد من الإلكترونات. كون الإكسوسومات أقل كثافة للإلكترون ، تسمح للحزمة بالمرور. يتم التقاط هذه الإلكترونات المتناثرة بشكل مختلف بواسطة نظام التصوير لتشكيل صورة عالية التباين.
تبدو الإكسوزومات الملطخة سلبا أفتح ، مع حدود داكنة حولها.
من أجل إجراء تلطيخ سلبي ، قم بإصلاح الإكسوسومات المنقاة بعد العزل باستخدام 1 مليلتر من 2٪ بارافورمالدهايد لمدة 5 دقائق. عالج الرقيقة فورمفار / فيلم الكربون المغلفة 200 شبكة النحاس EM مع تفريغ التوهج لمدة 1 دقيقة. ثم قم بتحميل 5 إلى 7 ميكرولتر من محلول تعليق الإكسوسوم على شبكة واحتضانه لمدة 1 دقيقة. إذا كان تركيز الإكسوسوم مرتفعا جدا ، فقم بتخفيف التركيز إلى مستوى مناسب.
على الفور ، قم بتلطيخ الإكسوسومات بحوالي 20 قطرة من محلول أسيتات اليورانيل المصفى بنسبة 1٪ على سطح شبكة EM. قم بإزالة محلول أسيتات اليورانيل الزائد من الشبكة عن طريق ملامسة حافة الشبكة بورق الترشيح. ثم اشطف الشبكة بسرعة بقطرة ماء.
استخدم زوجا من الملقط لوضع الشبكة على الطاولة ، وقم بتغطية الشبكة جزئيا بطبق ثقافة. اترك الشبكة تجف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتصوير الشبكة أو تخزينها في صندوق شبكة مجهر إلكتروني للمراقبة المستقبلية.