$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
التجميد المفاجئ هو تقنية يتم من خلالها تجميد عينات الأنسجة بسرعة إلى درجات حرارة شديدة البرودة. يساعد في الاحتفاظ بالبنية الأصلية للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات داخل الأنسجة.
لتجميد عضلة الأطراف ، ابدأ بأخذ أنسجة عضلية مستخرجة حديثا من الطرف الخلفي للفأر.
بعد ذلك ، خذ النيتروجين السائل في صندوق من الستايروفوم واغمر دورق يحتوي على الأيزوبنتان - سائل عالي التوصيل - في النيتروجين السائل.
قم بتجميد الأيزوبنتان حتى يصبح المحلول لزجا. في نفس الوقت ، ضع قطرة من وسائط التجميد السائلة فوق قطعة من الفلين.
ضع الأنسجة العضلية الخلفية عن طريق إمساك الوتر وتضمين قطعة الأنسجة عموديا في وسط التجميد السائل. يساعد هذا الاتجاه في التحديد اللاحق لمنطقة المقطع العرضي للعضلة.
اغمر قطعة الفلين بأنسجة عضلية متصلة لفترة وجيزة في حمام الأيزوبنتان المبرد مسبقا. هذا يساعد في تجميد الأنسجة العضلية بسرعة وحتى حتى الأنسجة العضلية.
يتجمد وسط التجميد عند درجة حرارة منخفضة ويشكل طبقة هلامية حول الأنسجة العضلية ، وتثبتها في مكانها. ضع كتلة العضلات في ميكروتوم بالتبريد للحصول على أقسام مقطعة إلى شرائح رفيعة.
ضع الأقسام على شرائح زجاجية وقم بتخزينها في درجة حرارة منخفضة لمزيد من التحليل النسيجي.
عندما يتم جمع جميع العضلات ، اغمر النصف السفلي من دورق بلاستيكي سعة 50 مليلتر يحتوي على الأيزوبنتان في النيتروجين السائل. عندما يصبح الأيزوبنتان لزجا قليلا مع بطانة صفائحية بيضاء صلبة مرئية داخل الدورق ، اسكب بضع قطرات من وسط التضمين على ظرف
بعد ذلك ، التقط عضلة من الوتر ووضع نهاية العضلة الجديدة بعناية أعلى وسط التضمين ، مع الاحتفاظ بها عموديا بالنسبة إلى الفلين. بعد ذلك ، مع الحفاظ على العضلات عمودية ، اغمس الظرف والعضلات المرفقة في حمام الأيزوبنتان لمدة 7 إلى 15 ثانية حتى يتم تجميد الأنسجة تماما. ستظهر العينة المجمدة جيدا باللون الأبيض الطباشيري. بعد ذلك ، ضع العضلة في أنبوب عينة للتخزين الفوري عند سالب 80 درجة مئوية.
للحفاظ على الحمض النووي الريبي والبنية الأنزيمية ونشاط العينات ، يلزم تجميد أنسجة العضلات في أسرع وقت ممكن بعد استخراجها.
لتقسيم الأنسجة العضلية المجمدة ، أولا ، اضبط درجة حرارة عمل الغرفة الداخلية الناجمة عن البرد على سالب 23 درجة مئوية. اسمح للعينة سالبة 80 درجة مئوية بالتأقلم مع درجة حرارة العمل لبضع ساعات. بعد ذلك ، احصل على أقسام متعددة بسمك 8 ميكرون من العينة في منطقة منتصف البطن من العضلات ، عموديا على محور التثبيت ، وجمع الأقسام على شرائح زجاجية بدرجة حرارة الغرفة أثناء قطعها. احتفظ بالعينات داخل غرفة ناظم التبريد حتى يتم جمع جميع الأقسام. بعد ذلك ، قم بتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.