عزل الخلايا أحادية النواة Lamina Propria: تقنية طرد مركزي متدرج الكثافة القائمة على السيليكا للحصول على خلايا أحادية النواة من القولون الفئران

تتكون الصفيحة المعوية ، الواقعة أسفل ظهارة الأمعاء ، من نسيج ضام فضفاض جنبا إلى جنب مع شبكة كثيفة من ألياف الكولاجين تحتوي على مجموعة متنوعة من الخلايا مثل الخلايا الليفية والخلايا أحادية النواة ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة. تلعب هذه الخلايا دورا مهما في الحفاظ على التوازن.

لعزل الخلايا أحادية النواة ، ابدأ بأخذ شظايا القولون الفأر. عالج الشظايا بمحلول هضم يحتوي على إنزيمات الكولاجيناز. تهضم إنزيمات الكولاجيناز ألياف الكولاجين داخل الأنسجة ، وتطلق الخلايا في حالة تعليق.

اجمع المادة الطافية وقم بتصفيتها من خلال مصافي الخلايا لإزالة الأنسجة غير المهضومة والحطام والحصول على معلق أحادي الخلية. أضف حاجزا مبردا إلى المرشح لتعطيل إنزيمات الكولاجيناز.

جهاز طرد مركزي لفصل الخلايا. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الإنزيمات وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط فصل منخفض الكثافة قائم على السيليكا. بعد ذلك ، ضع طبقة من التعليق فوق وسائط فصل عالية الكثافة قائمة على السيليكا لإنشاء تدرج فصل.

الطرد المركزي الخليط. ترسب الخلايا أحادية النواة وتشكل طبقة بيضاء عند الواجهة بين طبقات تدرج الكثافة. انقل طبقة الواجهة البيضاء بعناية إلى أنبوب جديد يحتوي على مخزن مؤقت مناسب.

جهاز طرد مركزي للحصول على حبيبات تحتوي على خلايا أحادية النواة منقاة. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لمزيد من التحليل النهائي.

للبدء ، أضف 20 مل من محلول هضم الكولاجيناز إلى الأنبوب الذي يحتوي على شظايا القولون المغسولة. أغلق الأنبوب وضعه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية بمعدل دوران 2 × جم لمدة 60 دقيقة. تأكد من أن شظايا الأنسجة في حركة مستمرة أثناء التقليب.

صب 5 ملليلتر من وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 66٪ في كل من أنابيب البولي بروبيلين الثلاثة المنفصلة سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك، استخدم ماصة مصلية سعة 25 مليلتر لجمع المادة الطافية فقط من Collagenase Digest 1. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية نسيجية مرشحة مسام سعة 40 ميكرولتر موضوعة في أنبوب مخروطي نظيف من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. املأ الأنبوب بالكامل بمحلول القولون المبرد لإخماد المخزن المؤقت لهضم الكولاجيناز. ثم قم بتدوير الخلايا ، واستنشق المادة الطافية ، واحتفظ بالحبيبات على الجليد.

استمر في إجراء Collagenase Digest 2 كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد اكتمال Collagenase Digest 2 ، اغسل شظايا الأنسجة بقوة ذهابا وإيابا بين الأنبوب وحقنة سعة 10 مليلتر من خلال إبرة حادة 18G. كرر هذا التدفق لمدة سبعة إلى ثمانية مقاطع على الأقل ، واستمر حتى لا تظهر شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام.

بعد ذلك ، قم بتمرير تعليق تفكيك الأنسجة من خلال مصفاة خلية نسيجية مرشحة مسام بحجم 40 ميكرومتر موضوعة في أنبوب بولي بروبيلين نظيف سعة 50 مل. املأ الأنبوب إلى الحافة بمحلول القولون المبرد لإخماد الهضم وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.

تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ واسحب الحبيبات المعلقة من Collagenase Digest 1 إلى الأنبوب المقابل لها. بعد ذلك, أعد تعليق كل حبيبات في 24 مل من 44٪ وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا لكل نقطة. استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لوضع طبقة ببطء من 8 ملليلتر من هذه الوسائط على كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على 66٪ من وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا.

قم بموازنة الأنابيب بعناية داخل جرافات أجهزة الطرد المركزي باستخدام ميزان الوزن أو الميزان. جهاز طرد مركزي عند 859 × جم وعند 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة دون انقطاع. اسمح للدوارات بالراحة الكاملة قبل إزالة الأنابيب ، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج.

تصور واجهة التدرج بالقرب من علامة 5 ملليلتر حيث يوجد عادة شريط أبيض بسمك 1-2 ملليمتر. قم بالشفط بالتفريغ والتخلص من أعلى 7 ملليلتر من التدرج للسماح بوصول الماصة بسهولة إلى الواجهة. باستخدام الشفط اليدوي المستمر وحركة المعصم الدوارة الثابتة ، اجمع طبقة واجهة الخلايا. اجمع حتى تصبح الواجهة بين التدرجات واضحة وقابلة للانكسار ، وانقل الواجهة إلى أنبوب مخروطي جديد من مادة البولي بروبيلين سعة 50 ملليلترا.