موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 2:42 دقيقة • April 30th, 2023
للكشف عن الإشارات الكروموجينيكية أثناء تهجين الحمض النووي الريبي ، ابدأ بأخذ قسم من الأنسجة على شريحة زجاجية. يحتوي هذا القسم على الحمض النووي الريبي المستهدف ، مهجن مسبقا باستخدام مسبار الحمض النووي الريبي المسمى بيروكسيداز الفجل.
استغن عن بضع قطرات من ديامينوبنزيدين أو DAB ، وهي ركيزة للكشف ، فوق قسم الأنسجة واحتضنها.
يدخل DAB إلى الخلية ، ويقوم إنزيم بيروكسيداز الفجل بأكسدة لتشكيل راسب بني. يضفي هذا التفاعل لونا بنيا على تسلسلات محددة من الحمض النووي الريبي في الخلية. الخلايا التي لا تحتوي على الحمض النووي الريبي المستهدف لن يكون لها نشاط بيروكسيداز وتبقى غير ملطخة.
بعد ذلك ، قم بمواجهة قسم الأنسجة بالهيماتوكسيلين. يرتبط الهيماتوكسيلين بالحمض النووي ويضفي صبغة أرجوانية على قسم الأنسجة.
عالج قسم الأنسجة بماء الأمونيا - محلول زرق. يقلل من شدة البقعة الأرجوانية ، مما يجعل الخلايا تبدو زرقاء. هذه الخطوة ضرورية للتصور الواضح للبقع البنية داخل الخلايا.
الآن ، اغمر قسم الأنسجة في زيادة تركيزات الإيثانول ثم عالجها بالزيلين - مذيب عضوي. تعمل هذه الخطوات على تجفيف قسم الأنسجة للحصول على صور أفضل.
أخيرا ، أغلق الشريحة بمحلول تثبيت وغطاء وتصور تحت المجهر الضوئي. تظهر الخلايا نقاطا بنية مثقبة تشير إلى وجود الحمض النووي الريبي المستهدف.
قم بتوزيع نفس عدد القطرات من كل محلول DAB-A و DAB-B في أنبوب بحجم مناسب لصنع ما يقرب من 120 ميكرولتر من ركيزة DAB لكل قسم ودوامة. خذ كل شريحة ، واحدة تلو الأخرى ، من رف الشرائح واضغط ونقر لإزالة السوائل الزائدة ، وضعها مرة أخرى في رف الشرائح. الماصة ما يقرب من 120 ميكرولتر من خليط DAB على كل قسم من أقسام الأنسجة ، مع التأكد من تغطية الأقسام. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واستمر في مكافحة التلوين.
ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت لكل شريحة زجاجية ثم ضع الشريحة على الشرائح واتركها تجف في الهواء. بعد بضع ساعات ، تابع التقييم باستخدام المجهر البصري كما هو موضح في المخطوطة.