تصنيع مصفوفة خارج الخلية من نموذج الفأر: إجراء فعال لتحضير مصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا من لسان الفئران

تتكون المصفوفة خارج الخلية أو ECM - المكون غير الخلوي لبيئة الأنسجة - من شبكة معقدة من البروتينات الهيكلية والتنظيمية والسكريات التي تفرزها الخلايا. يوفر ECM الدعم الهيكلي والكيميائي الحيوي للخلايا وينظم نموها.

لتحضير مصفوفة اللسان خارج الخلية ، ابدأ بأخذ لسان فأر تم حصاده حديثا. اغسله بالإيثانول لإزالة طبقة الدهون.

بعد ذلك ، قم بإخضاعه لدورات التجميد والذوبان بالتناوب. يعزز التجميد تكوين بلورات الجليد داخل الخلايا ، بينما يؤدي الذوبان إلى إذابة بلورات الجليد ، مما يؤدي إلى تعطيل الغشاء الخلوي.

الآن ، اللسان في محلول مضاد حيوي لمنع نمو البكتيريا. بعد ذلك ، عالج العضو بمحلول ملحي مفرط التوتر. في وجود تركيز عال من المذاب ، يتدفق الماء من الخلايا ، مما يؤدي إلى تقلصها. تساعد هذه الخطوة في الموت الخلوي والانفصال عن المصفوفة خارج الخلية.

احتضان اللسان في خافض للتوتر السطحي غير أيوني. يعمل الفاعل بالسطح على إذابة الأغشية الخلوية والنووية تماما ، مما يسهل إطلاق المحتويات داخل الخلايا في المحلول.

أخيرا ، قم بتعليق اللسان في محلول يحتوي على أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، متبوعا بمعالجة النوكليازات. تعزز أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم نشاط النوكليازات لتحلل أي أحماض نووية حرة في المحلول.

قم بتخزين أنسجة اللسان منزوعة الخلايا في مخزن مؤقت مناسب حتى مزيد من المعالجة.

بعد عزل الألسنة عن الفئران التي تم قتلها رحيما وفقا لبروتوكول النص ، اغمر الأنسجة في 75٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، انقل كل لسان إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مع 1 مليلتر من 10 مللي مولار معقم PBS. لإجراء تحلل الخلايا ، قم بتجميد الألسنة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإذابة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. كرر التجميد والذوبان مرتين أخريين.

بعد ذلك ، في طبق استزراع يبلغ طوله 3.5 سم أو 6 سم يحتوي على 75٪ من الإيثانول ، استخدم إبرة جراحية لتحميل كل لسان على قطعة من الخيط الجراحي ، وباستخدام قطعة صغيرة من رقائق القصدير المعقمة ، لف نهاية الخياطة. في طبق استزراع يبلغ طوله 3.5 سم أو 6 سم ، استخدم 3 ملليلتر من PBS لشطف كل لسان لمدة 30 ثانية. ثم ، في زجاجة واسعة الفم ، قم بإعداد 90 ميكروغراما لكل ملليلتر من الأمبيسلين في 250 مل من الماء المعقم فائق النقاء وأضف لوح التقليب.

قم بخفض ما يصل إلى 5 ألسنة في الزجاجة حتى تصبح على بعد حوالي 2 سم من القاع وشد الغطاء مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 12 ساعة. ثم ، بعد الحضانة ، قم بإعداد 250 مل من 90 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين في كلوريد الصوديوم المعقم 1 مولار. انقل الألسنة وحرك الشريط في الزجاجة وقم بربط الغطاء. ضع الزجاجة على النمام المغناطيسي لمدة 24 ساعة.

لإجراء تحلل الخلايا ، قم بإعداد 90 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين في 250 مل من 2٪ Triton X-100 المعقم في PBS. انقل الألسنة وشريط التقليب إلى الزجاجة وشد الغطاء. ثم حرك الزجاجة لمدة 48 ساعة. بعد تحضير كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم مع الأمبيسلين ، انقل المنديل وحرك الشريط في الزجاجة وحرك الزجاجة لمدة 24 ساعة.

تحضير 1 مليلتر من 300 ميكرومولار DNase في HBSS في أنبوب واحد لجهاز طرد مركزي دقيق لكل عينة لسان. انقل الألسنة إلى الأنابيب مع تعليق نفس الجزء من الخيط في الخارج. ثم احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انقل العينات مرة أخرى إلى زجاجة واسعة الفم من PBS المعقمة مع الأمبيسلين وضعها على النمام لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بتخزين مصفوفة اللسان المحضرة خارج الخلية ، أو TEM ، في PBS معقم عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.