إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد للزراعة المشتركة للعقد الجذرية الظهرية للفأر والخلايا السرطانية: نموذج في المختبر لدراسة غزو الخلايا السرطانية حول العصب

يشير الغزو حول العصب أو PNI إلى هجرة الخلايا السرطانية على طول الأعصاب وغزوها اللاحق إلى محيط العصب - وهي بيئة مكروية مناسبة لنمو السرطان ورم خبيث.

لتقليد PNI في المختبر ، ابدأ بإضافة قطرة من المصفوفة خارج الخلية أو تعليق ECM على طبق ثقافة بحيث يأخذ شكل نصف الكرة الأرضية. الآن ، احتضان طبق الثقافة لتعزيز السمات الهيكلية والوظيفية للسقالة ثلاثية الأبعاد.

بعد ذلك ، ضع بعناية عقدة الجذر الظهري أو DRG ، وهي مجموعة من الخلايا العصبية الحسية ، في وسط قطرة ECM شبه الصلبة. احتضان لتضمين DRG داخل قطرة ECM.

بعد ذلك ، أضف وسط نمو مناسب واحتضن. تفضل المغذيات المكملة ECM إنبات DRG في نتوءات عصبية صغيرة تسمى الخلايا العصبية التي تنمو شعاعيا باتجاه محيط القطرة.

قم بإزالة الوسيط المستهلك لإعداد قطرة ECM للفحص اللاحق. البذور تلطخ الخلايا السرطانية الملتصقة بالفلورسنت فوق القطرة. بسبب الشكل نصف الكروي ، تتدحرج الخلايا السرطانية وتستقر على طول محيط القطرات.

احتضان طبق الثقافة للسماح بالتفاعل بين الخلايا السرطانية والعصبية. عند النظر إليها تحت المجهر الفلوري ، يمكن رؤية الخلايا السرطانية تتعقب جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية وتهاجر نحو DRG ، مما يؤكد الغزو حول العصب.

لتحضير قطرات المصفوفة شبه الصلبة ، انقل صفيحة زجاجية واحدة قاع البئر من الجليد إلى كتلة ثلجية تحت مجهر التشغيل. ضع طرف ماصة لا تزيد عن 10 ميكرولتر مباشرة على الزجاج بزاوية 45 درجة وقم بتوزيع قطرة مصفوفة سعة 1.5 ميكرولتر بعناية على الزجاج. حرك طرف الماصة ببطء بعيدا عن الزجاج عندما تصبح المصفوفة متشابكة مع اللوحة.

قم بإيداع قطرة واحدة من المصفوفة على كل زاوية من الزوايا الأربع للوحة وانقل اللوحة إلى سطح درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة تقريبا. عندما تصلب المصفوفة قليلا ، أعد اللوحة إلى كتلة الجليد واستخدم ملقطا مجهريا مغلقا لغرف DRG برفق باليد اليسرى.

باستخدام اليد اليمنى ، انقل الأنسجة العصبية بعناية إلى طرف إبرة 21G واستخدم الإبرة لإدخال DRG برفق في منتصف قطرة المصفوفة. يجب أن يتم تحرير DRG بسهولة في المصفوفة لتحديد المواقع المركزية بالإبرة.

بعد إدخال قطعة DRG في كل قطرة من القطرات الأربع ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. عندما يتم تضمين كل DRG ، أمسك الألواح واحدة تلو الأخرى بزاوية طفيفة وأضف ببطء 4 ملليلتر من DMEM مكملا بنسبة 10٪ FBS إلى الألواح بحيث يتلامس الوسيط تدريجيا مع وحدات المصفوفة DRG.

أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 48 إلى 72 ساعة أخرى. عندما تصل الخلايا العصبية إلى 75٪ على الأقل من الطريق إلى حافة المصفوفة ، قم بشفط الوسط من الآبار دون إزالة وحدات المصفوفة-DRG. بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع زناد سلس ، ضع قطرتين من 3 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر من الوسط فوق كل مقايسة مصفوفة DRG وأعد الألواح إلى الحاضنة. بعد ساعة واحدة ، أضف برفق 4 ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS على طول الجدار الجانبي للوحة ذات القاع الزجاجي وأعد الألواح إلى الحاضنة حتى التقييم المجهري التالي.