JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 5:22 د • April 30th, 2023
يحتوي الورم على جزء صغير من الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المعروفة باسم السكان الجانبيين. هذه الخلايا مقاومة للكيماويات ، مما يجعلها مسؤولة عن انتكاسة السرطان.
لعزل المجموعة الجانبية للخلايا السرطانية ، ابدأ بإضافة Hoechst - محلول صبغة فلورية - إلى القارورة التي تحتوي على تعليق الخلايا السرطانية. داخل الخلايا السرطانية الطبيعية ، تدخل جزيئات Hoechst إلى النواة وترتبط بالمنطقة الغنية ب A-T في الحمض النووي ، مما يؤدي إلى ارتفاع التألق في هذه الخلايا.
في المقابل ، تحتوي المجموعة الجانبية على تركيز عال من ناقلات ABC - مضخات التدفق التي تزيل جزيئات الصبغة بسرعة من الخلية. هذا التدفق النشط لجزيئات الصبغة يجعل السكان الجانبيين يتألقون بكثافة منخفضة.
الآن ، خذ قارورة أخرى من الخلايا السرطانية المعالجة ب Hoechst وأضف إليها فيراباميل. تعمل هذه القارورة كعنصر تحكم حيث يمنع فيراباميل ناقلات ABC. تتسبب هذه الخطوة في تقليل تدفق Hoechst وتحتفظ بالصبغة داخل الخلايا السكانية الجانبية.
بعد ذلك ، قم بمواجهة الخلايا في كلتا القواريرتين باستخدام يوديد البروبيديوم. يدخل يوديد البروبيديوم حصريا إلى نواة الخلايا الميتة ويتقاطع بين قواعد الحمض النووي. هذا يؤدي إلى ارتفاع التألق في الخلايا الميتة.
أخيرا ، قم بفرز الخلايا باستخدام فارز الخلايا المنشط بالفلورة أو FACS. يفصل FACS الخلايا السرطانية عالية الفلورسنت والخلايا الميتة التي تحتفظ ب Hoechst عن الخلايا الجانبية منخفضة الفلورسنت.
لتحديد مجموعة جانبية من الخلايا الجذعية الشبيهة بالسرطان عن طريق مقايسة تدفق صبغة Hoechst ، أولا ، قم أولا بتسمية أنبوب مخروطي واحد "Hoechst" وآخر "Hoechst و Verapamil". بعد ذلك ، اغسل ثقافة خلايا HNSCC باستخدام PBS معقم ، متبوعا بإضافة 1 مليلتر من التربسين-EDTA. بعد 3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، أوقف التفاعل مع وسط زراعة الخلايا الطازجة واحسب الخلايا. تمييع الثقافة إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في وسط خط الخلية الأبوية كاملة.
ثم أضف 100 ميكرولتر إلى أنبوب "Hoechst and Verapamil" و 4 ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب "Hoechst". بعد ذلك ، امزج برفق 10 ميكرولترات من محلول هيدروكلوريد فيراباميل 5 ملليمولار في عينة "Hoechst and Verapamil" ، متبوعا ب 5 ميكرولتر من Hoechst لكل 1 في 10 إلى الخلايا السادسة لكلا الأنبوبين. ثم قم بتغطية العينات بورق الألمنيوم وضعها على حرارة 37 درجة مئوية. بعد 90 دقيقة مع الخلط اللطيف كل 15 دقيقة, الطرد المركزي الأنابيب وإعادة تعليق الكريات في 2 ملليلتر من PBS.
بعد الطرد المركزي الثاني ، قم بتعليق حبيبات "Hoechst and Verapamil" في 500 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في PBS وحبيبات "Hoechst" في 4 ملليلتر من نفس الشيء. الآن ، قم بتصفية العينات من خلال مصافي الخلايا 70 ميكرون في أنابيب FACS لإزالة أي مجاميع ووضع العينات على الجليد المحمي من الضوء. بعد ذلك ، قم بتحميل عينة "Hoechst" على مقياس التدفق الخلوي وافتح نافذة "ورقة العمل العالمية" في برنامج مقياس التدفق الخلوي. انقر فوق "Dot Plot" لإنشاء رسم بياني على ورقة العمل العالمية وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد معلمات المبعثر الأمامي والجانبي.
قم بإنشاء مبعثر جانبي عريض بواسطة مخطط نقطة ارتفاع مبعثر جانبي بنفس الطريقة ثم انقر فوق "بوابة المضلع" لإنشاء منطقة P1 في الرسم البياني الثاني لتحديد الخلايا المفردة والتمييز بين الزوجيات. بعد ذلك ، قم بإنشاء منطقة Hoechst حمراء بواسطة مخطط نقطة منطقة Hoechst أزرق وانقر بزر الماوس الأيمن على الخلايا لتمييز مجموعة P1. بعد ذلك ، قم بإنشاء منطقة P2 لتحديد مجموعة Hoechst الجانبية السلبية للخلايا التي تظهر كسلاح جانبي على يسار المجموعة الرئيسية للخلايا وجمع 10,000 من أحداث عينة "Hoechst".
للتأكد من أن بوابة P2 التي تمثل السكان الجانبيين قد تم وضعها بشكل صحيح ، اجمع 10,000 حدث عينة "Hoechst و Verapamil" أيضا. يجب أن يختفي السكان الجانبيون. بعد ذلك ، قم بفرز المجموعة الجانبية للخلايا السلبية لصبغ Hoechst إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 1 مليلتر من وسط الخلايا الجذعية الكاملة للسرطان. في نهاية الفرز ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات الجانبية في 1 مليلتر من وسط الخلية الشبيهة بالجذع السرطاني الطازج. بعد ذلك ، عد الخلايا وزرعها بالعدد المناسب في قارورة ثقافة خلية جديدة.