فحص موت الخلايا باستخدام تلطيخ DAPI: طريقة للفحص السريع لموت الخلايا المستنسخة الناجم عن الأشعة تحت الحمراء في خطوط الخلايا السرطانية

يمكن أن يتسبب التعرض للإشعاعات المؤينة مثل الأشعة السينية في تلف الحمض النووي ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا. لفحص تأثير الإشعاعات المؤينة على ملامح موت الخلايا ، ابدأ بأخذ طبق مزرعة يحتوي على خلايا سرطانية ملتصقة موضوعة على سطح الغطاء.

قم بإشعاع طبق الثقافة بالأشعة السينية للمدة المطلوبة. يتسبب هذا العلاج في تلف الحمض النووي داخل الخلايا. بعد ذلك ، استنشق الوسائط المستهلكة من طبق الثقافة وأضف مثبتا مناسبا. يتخلل هذا المحلول الخلايا ويغلق المكونات الخلوية في مكانها أثناء خطوات التلوين اللاحقة.

تجاهل المحلول التثبيتي. قم بإزالة الغطاء الذي يحتوي على الخلايا المعالجة بالأشعة السينية من طبق الثقافة. اقلب الغطاء وضعه على سطح شريحة زجاجية تحمل فوقه قطرة من بقعة DAPI بحيث تكون الخلايا على اتصال مباشر ب DAPI.

تدخل جزيئات DAPI إلى النوى وترتبط بمواقع الحمض النووي الغنية ب TEA. الآن ، تخيل الخلايا تحت المجهر الفلوري. تظهر النوى باللون الأزرق وتظهر أشكالا مميزة.

تدل الخلايا التي تظهر نوى مكثفة ومجزأة على موت الخلايا المبرمج ، وموت الخلايا المبرمج. يمثل البعض الآخر الذي يعرض نوى متعددة الفصوص أن الخلايا تعاني من كارثة انقسامية. أولئك الذين لديهم نوى مسطحة تظهر نقاطا مضيئة متعددة يوحي بالخلايا التي تتعرض للشيخوخة.

خذ الخلايا من الحاضنة واستنشق وسط الثقافة من طبق الثقافة. قم بقص طرف ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر على بعد حوالي 5 ملليمترات من النهاية باستخدام المقص ، واستخدمه لإضافة 1 مليلتر من محلول التثبيت إلى طبق الاستزراع.

ضع محلول التثبيت على طول جدران طبق الثقافة لتقليل الضرر الذي يلحق بالخلايا. بعد ذلك ، انقل طبق الثقافة هذا إلى طبق ثقافة مربع ورجه برفق لتوزيع محلول التثبيت بالتساوي على الغطاء. بعد ذلك ، احتضن الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

استنشق محلول التثبيت من الطبق. الآن ، أضف 2 مل من PBS على طول جدران الطبق ثم استنشق PBS. للتحضير لتلوين DAPI ، أضف 5 ميكرولتر من كاشف تلطيخ DAPI على شريحة زجاجية. بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء من الطبق باستخدام مشرط وقم بتصريف PBS الزائد على الغطاء عن طريق لمس حافة الغطاء بمنشفة ورقية.

الآن ، قم بتركيب الغطاء رأسا على عقب على قطرة كاشف تلطيخ DAPI على الشريحة الزجاجية بحيث تتعرض الخلايا لكاشف تلطيخ DAPI. أخيرا ، افحص الخلايا الملطخة تحت مجهر مضان مزود بمرشح DAPI.