ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير خطوط خلايا التصنيع للأدوية البيولوجية ذات الاستنساخ والإنتاجية العالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحويل الأول ، الخلية المضيفة مع الحمض النووي ، وترميز الجين محل الاهتمام. تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في عزل المستنسخة عالية الإنتاج بالحقائق ، متبوعة بتوثيق تكوين المستعمرة بواسطة جهاز تصوير تحديد الاستنساخ.

الخطوة الأخيرة هي فحص وتحديد المستنسخة عالية الإنتاجية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر إنتاج الأجسام المضادة في مزارع الدفعات المستمرة والمغذية من خلال HPLC في المرحلة العكسية. فيديو. يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم فرز الحقائق وخطوات pcan 80 dgl نظرا لوجود إعداد معقد في هذه الإجراءات ، وسيوضح العلماء التاليون من المختبر هذه الإجراءات لتعداء تأثير الخلية المضيفة ، وفرز جيسون ساندرز لتوثيق تكوين المستعمرة وراسل كان لأخذ عينات تيكان.

وإليزا لبدء هذا الإجراء قبل يوم واحد من التعداء ، تقوم الخلايا المضيفة في قارورة ثقافة الخلية في 15 مل من النمو. متوسط. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 7.5٪ من ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي ، وقم بإعداد مجمعات التعدي أولا تمييع ثمانية ميكروغرامات ، والحمض النووي في 800 ميكرولتر من وسط النمو بدون مصل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ممزوج برفق. بعد ذلك ، قم بتخفيف 40 ميكرولتر من الشفة في 800 ميكرولتر من وسط النمو بدون مصل في أنبوب البوليسترين.

أضف الحمض النووي المخفف إلى الليبوفيكتامين المخفف. تخلط بلطف وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحضير الخلايا المضيفة للتعدين. قم بإزالة وسط النمو من الخلايا واستبدلها ب 6.4 مل من وسط النمو بدون مصل.

أضف 1.6 مل من مجمعات التعدي إلى القارورة. تخلط برفق عن طريق هز القارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.

بعد ست ساعات ، أضف ثمانية ملليلتر من وسط النمو إلى القارورة واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون طوال الليل في اليوم التالي. قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط وأضف وسط نمو جديد إلى القارورة. احتضان الخلايا طوال الليل مرة أخرى بعد الحضانة الليلية.

استبدل وسط النمو بالاختيار. متوسط. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من نقلها ، تكون الخلايا جاهزة للاستنساخ عن طريق قياس التدفق الخلوي المنشط لفرز الخلايا المخلودة من القارورة وأجهزة الطرد المركزي عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

أعد تعليق الخلايا في وسط الاختيار ، مع استكمال 2٪ ألبومين مصل الأبقار. ثم أضف الجسم المضاد IgG المضاد للإنسان المسمى بالفلورسنت. أضف مخففا من واحد إلى 20 حضانة على الثلج لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، ثم اغسلها مرتين باستخدام PBS الباردة ، وأعد تعليق الخلايا في XPBS واحد في أنبوب بولي بروبلين.

مثال على الخلايا الملطخة في هذه الصورة للفرز المعقم على أغنية فاكس BD قم بإعداد لوحة ثقافة خلية 96 بئر تحتوي على 200 ميكرولتر وسط اختيار في كل بئر. قم بتحميل الأنبوب بالخلايا بشكل معقم وقم بتحليله على حقائق BD. Aria ، سجل نتائج الخلايا الملطخة وغير الملوثة على التوالي.

اضبط البوابات والإعدادات لفرز الخلايا المفردة لملف تلطيخ الفلورسنت المطلوب في لوحة 96 Well ، احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين في اليوم صفر ، واليوم الثالث ، واليوم السابع ، واليوم 13 بعد فرز الحقائق تكوين مستعمرة المستند في لوحة 96 بئر على جهاز تصوير تحديد استنساخ لضمان اختيار المستنسخة المشتقة من خلية واحدة للفحص والاختيار للحصول على إنتاجية عالية استنساخ. موقف عينة المستند الأول في لوحة فحص البئر 96 المتلقية. ثم استخدم نظاما آليا لمعالجة السوائل لنقل حصصات من 20 ميكرولترا من المادة الطافية إلى كل بئر من إنتاج الأجسام المضادة للوحة فحص البئر 96 في العينات التي يتم تحليلها بواسطة شطيرة.

يكتشف IgG البشري ELI SA على نظام مناولة السوائل بالطريقة التالية. أولا ، يتم تحميل العينات والمعيار على لوحات فحص IgG مضادة للإنسان مشفرة مسبقا. يتم تحضين الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، تليها ثلاث غسلات PBS.

المناعي التالي الماعز النقي المضاد للإنسان IgG. يضاف HRP إلى الألواح عند تخفيف من واحد إلى 2000 ويتم تحضين الألواح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، يتم غسل الألواح ثلاث مرات باستخدام PBS ثم تضاف ركيزة A BTS.

أخيرا ، تكون اللوحات حمراء على قارئ اللوحة باستخدام الامتصاص عند 405 نانومتر للكشف. باستخدام هذه المنصة الآلية ، وجد أن مستوى الجسم المضاد السطحي المنعكس عن طريق تلطيخ IgG المضاد للإنسان الفلوري المرتبط بإنتاجية الأجسام المضادة للخلية. كما هو موضح هنا بالنسبة لأعلى اثنين من المستنسخة التي تم إنشاؤها من مجموعة الخلايا ذات التعبير العالي عن الأجسام المضادة السطحية ، تراوحت الإنتاجية المحددة من 50 إلى 70 بيكوغراما لكل خلية في اليوم.

في المقابل ، كانت إنتاجية الأجسام المضادة حوالي 20 بيكوغراما لكل خلية يوميا لأعلى اثنين من المستنسخة التي تم إنشاؤها من مجموعة الخلايا ذات التعبير المنخفض عن الأجسام المضادة السطحية. علاوة على ذلك ، فإن خطوط الخلايا التي تم تطويرها عن طريق فرز الحقائق أكثر استقرارا فيما يتعلق بإنتاج الأجسام المضادة من تلك التي تم استنساخها من خلال التخفيف اليدوي المحدد. انخفضت الإنتاجية المحددة لاستنساخ الاستنساخ العلوي الذي تم إنشاؤه بواسطة التخفيف اليدوي من حوالي 30 PCD إلى ما يقرب من 10 PCD بعد زراعة 80 مضاعفة خلية.

من ناحية أخرى ، كان الاستنساخ الفرعي العلوي الناتج عن استنساخ فرز الفاكس الثاني قادرا على الحفاظ على الإنتاجية المحددة حوالي 20 PCD لمضاعفة 100 خلية على الأقل. أظهر تحديد موقع تكامل الجينات المعدلة وراثيا في كروموسوم الخلية عن طريق التهجين الفلوري في الموقع أن الاستنساخ هو مجموعة مختلطة من النمط الظاهري أ والنمط الظاهري B.In على النقيض من ذلك ، يبدو أن الاستنساخ المصنف هو مجموعة أكثر تجانسا مع 99.5٪ من خلايا النمط الظاهري أ.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير خطوط خلايا التصنيع لحماية البروتينات العلاجية.