ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير خطوط خلايا تصنيعية للمستحضرات الحيوية تتميز بالنسيلية والإنتاجية العالية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفيكشن الخلية المضيفة بالـ DNA الذي يشفر الجين المستهدف. وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في عزل المستنسخات عالية الإنتاجية بواسطة facs، يليه توثيق تكوين المستعمرات باستخدام جهاز clone select imager.

تتمثل الخطوة النهائية في فحص واختيار المستنسخات عالية الإنتاجية. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر إنتاج الأجسام المضادة في المزارع المتقطعة والمغذاة من خلال تقنية HPLC ذات الطور المعكوس. ويُعد عرض هذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الفرز وpcan 80 dgl يصعب تعلمها نظراً لتضمن هذه الإجراءات إعدادات معقدة؛ لذا سيقوم العلماء التاليون من المختبر بشرح هذه الإجراءات: سيقوم جيسون ساندرز بتوضيح تأثير ترانسفكشن الخلية المضيفة وتوثيق تكوين المستعمرات، بينما سيقوم راسل كان بتوضيح أخذ العينات باستخدام tecan.

لبدء هذا الإجراء قبل يوم واحد من عملية عفن الخلايا (transfection)، يتم استزراع الخلايا المضيفة في قارورة زراعة خلايا في 15 milliliters من وسط النمو. تُحضن الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و7.5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، يتم تحضير معقدات عفن الخلايا؛ أولاً، يتم تخفيف 8 µg من DNA في 800 µL من وسط النمو الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم مع الخلط بلطف. بعد ذلك، يتم تخفيف 40 µL من lip في 800 µL من وسط النمو الخالي من المصل في أنبوب من البوليسترين.

أضف الحمض النووي DNA المخفف إلى Lipofectamine المخفف. اخلط المزيج بلطف واتركه للحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتهيئة الخلايا المضيفة لعملية عفن الخلية (transfection). قم بإزالة وسط النمو من الخلايا واستبدله بـ 6.4 milliliters من وسط نمو خالٍ من المصل.

أضف 1.6 milliliters من معقدات عفن النقل (transfection complexes) إلى القارورة. اخلط المزيج بلطف عن طريق هز القارورة. حضن الخلايا عند 37 degrees Celsius في حضانة ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.

بعد مرور ست ساعات، أضف ثمانية ملليلترات من وسط النمو إلى القارورة واحضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون طوال الليل في اليوم التالي. قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط وأضف وسط نمو جديداً إلى القارورة. احضن الخلايا طوال الليل مرة أخرى بعد فترة الحضانن الليلية.

استبدل وسط النمو بوسط الانتخاب. قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة Celsius في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد مرور أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من عملية التحول (transfection)، تصبح الخلايا جاهزة للاستنساخ عن طريق فرز الخلايا المنشط بالتدفق الخلوي (flow cytometry activated cell sorting)؛ قم بفصل الخلايا من الفلاسکة ثم قم بطردها مركزياً عند 800 RPM لمدة خمس دقائق عند 4 درجة Celsius.

أعد تعليق الخلايا في وسط الانتقاء، المكمل بـ 2% bovine serum albumin. ثم أضف جسم مضاد anti-human IgG المسمى فلوريسنتياً. أضف تخفيفاً بنسبة واحد إلى 20 واحضن العينة على الثلج لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة، ثم اغسلها مرتين باستخدام PBS بارد وأعد تعليق الخلايا في XPBS واحد في أنبوب بولي بروبيلين.

تظهر في هذه الصورة عينة من الخلايا المصبوغة لإجراء الفرز العقيم باستخدام جهاز BD FACS Aria؛ قم بتجهيز طبق زراعة خلايا مكون من 96 بئراً يحتوي كل بئر منها على 200 µL من وسط الانتخاب. قم بتحميل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بطريقة عقيمة وتحليلها باستخدام جهاز BD FACS Aria، ثم سجل النتائج للخلايا المصبوغة وغير المصبوغة على التوالي.

قم بضبط البوابات والإعدادات لفرز الخلايا المفردة ذات ملف التلوين الفلوري المطلوب في طبق بـ 96 بئرًا، ثم حضّن الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة أسبوعين. في اليوم صفر، واليوم الثالث، واليوم السابع، واليوم 13 بعد عملية الفرز، قم بتوثيق تكوين المستعمرات في الطبق ذو الـ 96 بئرًا باستخدام جهاز تصوير اختيار النسائل (clone select imager) لضمان اختيار النسائل المشتقة من خلية مفردة لفحص واختيار النسائل عالية الإنتاجية. أولاً، وثّق موضع العينة في طبق المقايسة المستلم ذو الـ 96 بئرًا. بعد ذلك، استخدم نظامًا آليًا لمناولة السوائل لنقل حصص مقدارها 20 µL من الرائق إلى كل بئر في طبق المقايسة ذو الـ 96 بئرًا. ويتم تحليل إنتاج الأجسام المضادة في العينات عن طريق مقايسة شطائرية (sandwich).

يتم الكشف عن IgG البشري باستخدام تقنية ELI SA على نظام مناولة السوائل بالطريقة التالية. أولاً، يتم تحميل العينات ومحلول قياسي على ألواح مقايسة مغلفة مسبقاً بـ anti-human IgG. تُحضن الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، يتبع ذلك ثلاث غسلات بمحلول PBS.

بعد ذلك، يُضاف الجسم المضاد لـ IgG البشري من الماعز النقي مناعيًا (Next immuno pure goat anti-human IgG) المرتبط بإنزيم HRP إلى الأطباق بتخفيف 1 إلى 2000، وتُحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور ساعة، تُغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم تُضاف مادة الركيزة A BTS.

أخيراً، يتم قراءة الأطباق باستخدام قارئ الأطباق عن طريق قياس الامتصاصية عند 405 نانومتر للكشف. وباستخدام هذه المنصة المؤتمتة، وُجد أن مستوى الأجسام المضادة السطحية، والذي يتم تحديده من خلال الصبغ بـ anti-human IgG المسمى فلوروسنتياً، يرتبط بإنتاجية الأجسام المضادة للخلية. وكما هو موضح هنا لأفضل اثنين من المستنسخات الناتجة من المجموعة الخلوية ذات التعبير العالي للأجسام المضادة السطحية، تراوحت الإنتاجية النوعية من 50 إلى 70 بيكوجرام لكل خلية في اليوم.

في المقابل، بلغت إنتاجية الأجسام المضادة نحو 20 picograms لكل خلية في اليوم لأفضل مستنسخين تم الحصول عليهما من المجموعة الخلوية ذات التعبير المنخفض للأجسام المضادة السطحية. علاوة على ذلك، فإن الخطوط الخلوية التي تم تطويرها عن طريق الفرز بواسطة تقنية FACS كانت أكثر استقراراً فيما يتعلق بإنتاج الأجسام المضادة مقارنة بتلك التي تم استنساخها عبر التخفيف المحدود اليدوي. وقد انخفضت الإنتاجية النوعية لأفضل مستنسخ (المستنسخ رقم واحد) الناتج عن التخفيف المحدود اليدوي من نحو 30 PCD إلى نحو 10 PCD بعد استزراعه لـ 80 تضاعفاً خلوياً.

من ناحية أخرى، تمكن أفضل استنساخ فرعي ناتج عن فرز FACS للاستنساخ الثاني من الحفاظ على إنتاجية نوعية تبلغ حوالي 20 PCD لمدة 100 تضاعف خلوي على الأقل. وقد أظهر تحديد موقع دمج الجين المنقول في كروموسوم الخلية بواسطة التهجين الموضعي المتألق (FISH) أن الاستنساخ الأول عبارة عن مجتمع مختلط من النمط الظاهري A والنمط الظاهري B. في المقابل، بدا الاستنساخ الذي تم فرزه بواسطة FACS مجتمعًا أكثر تجانسًا، حيث كانت 99.5% من الخلايا من النمط الظاهري A. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير خطوط خلوية تصنيعية لإنتاج البروتينات العلاجية.