زراعة الغلاف الصالحي من أنسجة الغدة اللعابية: طريقة لتطوير الغلاف الصالحي من الخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية البشرية

الغلاف الصالحي في المختبر ، ثقافات ذاتية التجميع للخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية. لزراعة الكرات الكريمة ، ابدأ بأخذ أنسجة الغدد اللعابية البشرية في صفيحة مزرعة.

باستخدام المقص ، افرم الأنسجة إلى قطع رفيعة. بعد ذلك ، استكمل هذه القطع بمحلول تفكك يحتوي على الكولاجيناز والإنزيمات المتباينة واحتضانها. تهضم هذه الإنزيمات المصفوفة خارج الخلية الموجودة في الأنسجة.

علاوة على ذلك ، triturate لتجانس الأنسجة. تطلق هذه الخطوة الخلايا الظهارية وكرات الدم الحمراء في المحلول. بعد ذلك ، استخدم مصفاة خلوية وقم بتصفية الأنسجة المتجانسة في أنبوب مخروطي جديد لإزالة قطع الأنسجة غير المهضومة والحطام. جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء. يؤدي هذا المخزن المؤقت إلى تمزق كرات الدم الحمراء الموجودة في معلق الخلية.

الآن ، جهاز الطرد المركزي لتكوير الخلايا الظهارية. أعد تعليق الحبيبات في وسط نمو الخلايا الظهارية المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد لوحة ثقافة الكرة الأرضية عن طريق طلاء بئرها بمصفوفة غشاء القاعدي المسال أو BMM. احتضان للسماح للمصفوفة بالتصلب.

أخيرا ، أضف تعليق الخلية الظهارية إلى الآبار المطلية ب BMM. في وجود وسط النمو ، تلتصق الخلايا الظهارية بطبقة BMM وتتكاثر في الكرات الكروية.

في غضون ساعتين إلى أربع ساعات بعد الإزالة من المريض ، على لوحة الثقافة ، استخدم مقص تشريح معقم بالأوتوكلاف والملقط الجراحي لفرم أنسجة الغدد اللعابية إلى قطع دقيقة بحجم 1 إلى 2 ملليمتر. أضف 6 ملليلتر من محلول التباين / الكولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة تقريبا.

قم بتعطيل الأنسجة عن طريق سحب العينة باستخدام الماصة المصلية سعة 5 ملليلتر، من 15 إلى 20 مرة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إلى ساعة واحدة. كرر خطوة سحب العينات والحضانة مرتين إلى ثلاث مرات أخرى أو حتى يشبه النسيج الملاط ويمكن أن يمر بسهولة عبر فتحة الماصة.

لطلاء الآبار ب BMM ، قم ببسط 500 ميكرولتر من BMM المذاب طوال الليل في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار. قم بتدوير اللوحة ببطء لتوزيع BMM بالتساوي على الآبار. بعد ذلك ، قم باحتضان الألواح المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام للسماح ل BMM بالتصلب.

انقل محلول التباين / الكولاجيناز الذي يحتوي على أنسجة متجانسة إلى أنبوب مخروطي 15 ملم. اغسل جدار اللوحة مرة واحدة باستخدام 6 ملليلتر من DPBS لنقل الخلايا المتبقية إلى الأنبوب المخروطي. بعد ذلك ، من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون سعة 70 ميكرومتر ، قم بتصفية المتجانس في أنبوب مخروطي جديد 50 ملم لإزالة الأنسجة غير المهضومة.

الطرد المركزي تجهد الخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم. ثم, أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من 1x مخزن تحلل كرات الدم الحمراء. احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 20 إلى 25 ملم من DPBS لتحييد المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء وتقليل تحلل الخلايا اللعابية.

جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم. تشير حبيبات الخلية البيضاء إلى التحلل الكامل لجميع كرات الدم الحمراء. إذا كانت الحبيبات ذات لون أحمر ، كرر العلاج باستخدام مخزن تحلل كرات الدم الحمراء. قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 إلى 2 مل من BEGM ثم انقل الخلايا المعلقة إلى آبار مغلفة ب BMM.

احتضان عند 37 درجة مئوية. بمجرد طلاءها على BMM ، ستتشكل الخلايا في هياكل كروية أو كرات صلابية على مدى يومين إلى ثلاثة أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا ككرات كريمة لمدة خمسة إلى سبعة أيام قبل أن يبدأ BMM في التحلل ، مما يسمح للخلايا بالوصول إلى البلاستيك والالتصاق به والنمو كطبقة أحادية.