تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية: طريقة لتحديد الحمض النووي خارج الخلية في أقسام أنسجة FFPE

تطلق الخلية المحتضرة جزءا من الحمض النووي خارج الخلية يسمى الحمض النووي خارج الخلية. لتلطيخ الحمض النووي خارج الخلية ، ابدأ بأخذ قسم أنسجة مثبت بالفورمالين ، أو FFPE ، على شريحة زجاجية. قم بتسخين الشريحة الزجاجية للمدة المطلوبة. هذا يسهل ربط الأنسجة على سطح الشريحة ويخفف البارافين المحيط.

اغمر الشريحة في سائل إزالة البارافين لإذابة طبقة البارافين تماما حول الأنسجة. بعد ذلك ، قم بغمس الشريحة في تركيزات متناقصة من الإيثانول لإعادة ترطيب الأنسجة منزوعة البارافين. بعد الجفاف ، اغمر الشريحة في محلول استرجاع المستضد المغلي. يكشف هذا العلاج عن الحلقات التي تم تغييرها أثناء عملية التثبيت.

قم بتراكب الشريحة بالأجسام المضادة الأولية واسمح لها بالارتباط بحواتم محددة غير مقنعة موجودة في الخلية. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. اغمس الشريحة في محلول سودان الأسود لتقليل التألق الذاتي في الخلفية.

أخيرا ، ضع قطرة من وسط التثبيت المكمل ب DAPI فوق قسم المناديل وأغلقها بغطاء غطاء. احتضان للسماح لجزيئات DAPI بتلطيخ الحمض النووي. تصور قسم الأنسجة المحضرة باستخدام المجهر الفلوري. تساعد الحواتم المصنفة بالفلورسنت في الخلية في تمييز الحمض النووي النووي الموجود داخل الخلية عن الحمض النووي خارج الخلية.

لتلوين الحمض النووي خارج الخلية ، أولا ، قم بتسخين العينات ذات الأهمية في رف الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة قبل غمر الشرائح في تغييرين لمدة 40 دقيقة من المذيبات في غطاء الدخان. بعد الغمر الثاني ، أعد ترطيب العينات مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪ ومرة واحدة في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل معالجة.

بعد العلاج الأخير ، استخدم الملقط لوضع الشرائح في محلول استرجاع المستضد المغلي في قدر الضغط على حرارة عالية لمدة 10 دقائق. بعد كشف حواتم المستضد ، انقل قدر الضغط من الحرارة إلى الحوض وقم بتشغيل ماء الصنبور البارد على الفور فوق الغطاء.

اسمح للشرائح بالتوازن لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد قبل غسل العينات مرتين في 0.01 مولار PBS على شاكر مداري لمدة 5 دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل الثاني ، استخدم قلما كارها للماء لرسم دوائر حول عينات أنسجة الكلى ومنع أي تلطيخ غير محدد باستخدام 60 ميكرولترا من مصل الدجاج بنسبة 10٪ في ألبومين مصل بقري بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، استبدل محلول الحجب بعناية ب 60 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية في غرفة الرطوبة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح على شاكر مداري في PBS لمدة دقيقتين لكل غسلة قبل إضافة 60 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي المناسب المترافق بالفلوروفور إلى كل شريحة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح في PBS كما هو موضح ، متبوعا بالمعالجة في 0.3٪ سودان أسود في 70٪ إيثانول لإخماد أي تألق ذاتي محتمل ناتج عن الفورمالين. بعد 30 دقيقة ، اغسل الشرائح بماء الصنبور لإزالة أي رواسب واغمر الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق لمنع أي تراكم إضافي لترسيب السودان الأسود.

في نهاية الحضانة ، قم بتركيب الشرائح على أغطية زجاجية متحدة البؤر مع قطرات سعة 360 ميكرولتر من محلول التثبيت المكمل ب DAPI وقم بإغلاق الغطاء بطلاء الأظافر. اترك الشرائح تلتجأ لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى التصوير عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر وفقا للبروتوكولات القياسية.