موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:45 دقيقة • April 30th, 2023
الخلايا الملساء البديلة ، أو DSM ، الموجودة داخل جدار المثانة البولية الوحدة الوظيفية الأساسية للمثانة. تسترخي هذه الخلايا لتسهيل تخزين البول في المثانة وتنقبض لإطلاق البول.
لعزل خلايا DSM ، ابدأ بأخذ عينة من المثانة البولية البشرية المحصودة. اغسل العينة لإزالة أي آثار للدم والحطام. بعد ذلك ، قم بتأمين الأنسجة بحيث يكون سطحها المخاطي متجها لأعلى. استئصال الدهون والأوعية الدموية والطبقة المخاطية لكشف طبقة العضلات الأساسية المبتروسور. ثم قم بتقطيع الأنسجة الخالية من الغشاء المخاطي إلى أجزاء صغيرة.
عالج شظايا الأنسجة بكوكتيل الهضم الذي يحتوي على غراء واحتضانه. غراء ، إنزيم محلل للبروتين ، يعزز هضم البروتينات في المصفوفة خارج الخلية التي تربط الخلايا معا وتبدأ في ارتخاء الخلايا في المصفوفة. الآن ، قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على غراء.
أضف تعليق إنزيم الكولاجيناز إلى شظايا الأنسجة واحتضانه في درجة حرارة فسيولوجية. يكسر الكولاجيناز المصفوفة خارج الخلية ويسهل تفكك خلايا DSM. تساعد الحضانة في درجة الحرارة الفسيولوجية في الحفاظ على سلامة خلية DSM. تخلص من المادة المطفية المحتوية على الكولاجيناز.
اغسل شظايا الأنسجة بمحلول بارد مثلج لإزالة أي إنزيمات متبقية. ثم أعد تعليقها في المخزن المؤقت. قم بترتيورث شظايا الأنسجة المعالجة بالإنزيم برفق لضمان التفكك الكامل لأي خلايا غير مفرج عنها والحصول على تعليق أحادي الخلية لخلايا DSM. قم بتخزين خلايا DSM في درجات حرارة منخفضة حتى الاستخدام الآخر.
ابدأ بفحص عينة المثانة البولية بسماكة كاملة. قم بتثبيت العينة ، الغشاء المخاطي المتجه لأعلى والمصل لأسفل ، على طبق دائري مطلي بالسيليكون مقاس 150 ملم مليء ب DS المثلج ، وقم بإزالة كل الغشاء المخاطي بعناية عن طريق التشريح الحاد.
قطع العديد من قطع العضلات الملساء أو DSM الخالية من الغشاء المخاطي. ضع 3 إلى 6 قطع DSM في أنبوب به 1 إلى 2 مل من DS الدافئ مسبقا الذي يحتوي على غراء وديثيوثريتول أو DS-P. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة ، مع التأكد من هز الأنبوب كل 10 إلى 15 دقيقة.
بعد الحضانة ، قم بإزالة DS-P من الأنبوب واغسل قطع DSM لفترة وجيزة باستخدام DS المثلج. انقل DS مع قطع DSM إلى أنبوب جديد وقم بإزالة DS ، مع ترك قطع DSM في الجزء السفلي من الأنبوب. أضف 1 إلى 2 مل من DS المحتوي على الكولاجيناز من النوع الثاني أو DS-C إلى الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز العرضي.
تخلص من DS-C واغسل قطع DSM المعالجة بالإنزيم من 5 إلى 10 مرات باستخدام DS المثلج. بعد الغسيل الأخير، اترك DS داخل الأنبوب وقم بترتيبتيه القطع برفق باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار لتحرير خلايا DSM مفردة.