تحليل المشبك المثقوب بوساطة الأمفوتريسين-B: تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لدراسة التيارات الأيونية في خلايا المثانة البولية

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 4:20 د • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح تقنية المشبك المثقوب بالقياسات في الوقت الفعلي للتيارات الأيونية المرتبطة بنشاط القنوات الأيونية على خلايا مثل العضلات الملساء المثقبة ، أو DSM ، خلايا المثانة البولية.

للبدء ، قم بتحميل تعليق خلية DSM على غرفة زجاجية واحتضانها للسماح بالالتصاق الخلية. بعد ذلك ، أضف محلولا خارج الخلية يحتوي على أيونات رباعي إيثيل الأمونيوم والسيزيوم إلى الخلايا الملتصقة. تحجب هذه الكاتيونات قنوات البوتاسيوم على غشاء الخلية وتمنع تيارات البوتاسيوم المتداخلة.

بعد ذلك ، خذ ماصة مصقولة - أنبوب زجاجي مجوف رفيع يحتوي على قطب تسجيل متصل بمكبر للصوت. املأ الماصة الأمامية بمحلول داخل الخلايا وردم ملها بنفس المحلول ولكنه يحتوي على الأمفوتريسين-B، وهو مضاد حيوي مثقب غشائي

الآن ، اغمر طرف الماصة في محلول خارج الخلية الذي يحتوي على خلايا DSM. بعد ضبط الإمكانات والتيار على المستويات المناسبة، ادفع طرف الماصة باتجاه غشاء الخلية وراقب مقاومة القطب الكهربائي في نفس الوقت.

تشير الزيادة السريعة في قيمة المقاومة إلى أن طرف الماصة قد وصل إلى غشاء الخلية. الآن ، قم بتطبيق شفط لطيف على القطب الكهربائي لتشكيل ختم محكم يسمى ختم جيجا بين طرف الماصة وغشاء البلازما.

بعد تكوين الختم ، ينتشر الأمفوتريسين ببطء في الطرف ويثقب الغشاء ، مكونا مسام أيونية. بمجرد تحقيق التثقيب الأمثل ، تتحرك الأيونات بين الخلايا والقطب ، مما يولد تيارات تتناسب مع وظيفة القناة الأيونية.

ماصة 0.25 إلى 1 مليلتر من تعليق الخلية على حجرة ذات قاع زجاجي تجلس على منصة المجهر المقلوب واحتضانها لمدة 45 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق. ثم قم بإزالة DS من الحمام واستبدله بمحلول E عن طريق الصهار.

اسحب أقطاب كهربائية متعددة ، وقم بتلميع أطراف القطب الكهربائي بالنار ، وقم بتغطية الأطراف بشمع الأسنان إذا لزم الأمر. املأ طرف قطب الرقعة بمحلول الماصة بدون أمفوتريسين-B عن طريق غمس القطب الكهربائي لفترة وجيزة في المحلول. يعتمد نجاح الفيزيولوجيا الكهربية المشبك على جودة خلية DSM وذوبان الأمفوتريسين-B.

قم بإعادة ملء القطب بنفس محلول الماصة الذي يحتوي على الأمفوتريسين-B وقم بتركيب القطب الكهربائي على حامل متصل بمرحلة رأس مضخم التصحيح المشبك استخدم مناور دقيق لوضع القطب الكهربائي أسفل سطح المحلول خارج الخلية مباشرة بحيث يتم غمر طرف القطب الكهربائي.

بعد ذلك ، حدد مقاومة القطب الكهربائي باستخدام وظيفة نافذة اختبار الغشاء لبرنامج الاستحواذ التجاري وتقدم القطب نحو الخلية ذات الأهمية. عند لمس سطح الخلية بالقطب الكهربائي ، قم بتشكيل ختم جيجا عن طريق تطبيق ضغط سلبي سريع لطيف على القطب الكهربائي عبر الأنابيب. ينتج عن هذا ضغط سلبي عند طرف القطب ، مما يؤدي إلى ختم جيجا ناجح كما أكده اختبار الغشاء.

اترك 30 إلى 60 دقيقة حتى ينتشر الأمفوتريسين-B أسفل الماصة ويتم إدخاله في غشاء البلازما ، مما يشكل مساما انتقائية بشكل أساسي للكاتيونات أحادية التكافؤ. استمر في مراقبة ختم الجيجا باستخدام وظيفة اختبار الغشاء.

عندما يكون ثقب الرقعة هو الأمثل ، قم بإلغاء عابرات السعة عن طريق ضبط الأقراص لسعة الخلية ومقاومة السلسلة على مكبر الصوت. بمجرد ملاحظة التيارات الكاتيونية المستقرة للجهد الكهربائي ، قم بتسجيل التيارات باستخدام بروتوكول خطوة جهد التوجيه كما هو موضح في المخطوطة.

07:23

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:00

التصحيح تسجيلات المشبك على سليمة الظهرية جذر العقد من الجرذان الكبار

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:25

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:19

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

11:02

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

02:50

تسجيلات مشبك التصحيح المثقبة لأجسام الخلايا العصبية الحسية للأذن الداخلية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

11:51

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:14

شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:17

التسجيلات الكهرولوجية للتيارات الأيونية أحادية الخلية تحت ضغط القص المحدد جيداً

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:30

إعداد واستخدام خلايا العضلات الملساء الإنسان معزولة حديثا لتوصيف 9-فينانترول الحساسة التيارات التيشن

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 22 أغسطس 2026