عزل الكبيبات: تقنية للحصول على كبيبات سليمة من كلية الفئران

في الكلى الفقارية ، تتكون النيفرون من كبيبات متعددة - شبكة كثيفة من الأوعية الدموية - والتي تلعب دورا أساسيا في ترشيح الفضلات من الجسم.

لعزل الكبيبات ، ابدأ بأخذ كلية فأر تشريح حديثا. استخدم الملقط لتقشير الكبسولة الكلوية من الكلى ووضع الكلية النظيفة في طبق مزرعة جديد. الآن ، ضع الطبق فوق الثلج لتجنب تدهور الكلى. افرم الكلى إلى قطع صغيرة.

بعد ذلك ، أعد تعليق قطع الكلى المفرومة في محلول عازل مناسب. قم بتصفية تعليق الأنسجة من خلال مرشح شبكي كبير الحجم واجمع التدفق في طبق طازج. كرر هذه الخطوة عدة مرات مع تقليل حجم الشبكة تدريجيا في كل مرة ، حتى تنفصل الكبيبات عن شظايا الكلى.

أخيرا ، اغسل الفلتر بوسائط الثقافة المطلوبة لجمع الكبيبات الأصغر المحبوسة بينما تبقى شظايا الكلى في المرشح. انقل الكبيبات إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية. تصور اللوحة باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

بمساعدة ماصة دقيقة ، التقط كبيبة واحدة وانقلها إلى بئر جديد. استكمل البئر بوسائط الاستزراع واستخدم الكبيبة المعزولة لمزيد من التحليل.

بعد تحرير الكلى كما هو موضح في المخطوطة النصية ، أمسك الكلية بالملقط الجراحي واستخدم زوجا آخر من الملقط لسحب الكبسولات الكلوية. بعد ذلك ، ضع الكلى في آبار صفيحة استزراع مكونة من 6 آبار تحتوي كل منها على 2 مل من HBSS وضع صفيحة الثقافة على الجليد.

بعد ذلك ، انقل الكلى إلى طبق بتري 100 ملم واستخدم مشرطين لفرمهما إلى قطع صغيرة يتراوح حجمها من 1 إلى 2 ملليمتر. حافظ على قطع الكلى المفرومة مبللة باستخدام HBSS.

بعد ذلك ، ضع قطع الكلى فوق منخل معدني 300 ميكرومتر واضغط على الكلية من خلال المنخل باستخدام المكبس من حقنة سعة 20 ملليلترا. اشطف المنخل بشكل متكرر باستخدام HBSS بينهما واستخدم ماصة مصلية لجمع التدفق ونقله إلى طبق بتري نظيف.

استخدم مشرطا لكشط كل ما تبقى في قاع الغربال ونقله إلى تجانس الكلى الذي تم جمعه. شطف الكلى متجانسة من خلال غربال 75 و 53 ميكرومتر مع HBSS. بعد ذلك ، اغسل كلا المناخلين باستخدام HBSS لإزالة جميع الهياكل الأصغر.

اجمع هياكل الكلى والمواد المتبقية في المناخل عن طريق غسل السطح العلوي لكل منها باستخدام DMEM مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 20٪ ونقل المادة إلى آبار صفيحة دقيقة ذات 6 آبار منخفضة للغاية.

أحضر الصفيحة الدقيقة ذات التركيب المنخفض للغاية إلى مجهر ضوئي مقلوب واستخدم ماصة سعة 20 ميكرولترا لتجميع كبيبات واحدة مغلفة و/أو غير مغلفة.