JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 2:42 د • April 30th, 2023
الكرويات السرطانية هي مجاميع خلوية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية. يمكن تضمين هذه الكرويات في مصفوفة الكولاجين ، مما يؤدي إلى تكوين كتل كروية. لتجميد كتلة كروية سريعا ، ابدأ بوضع كتلة كروية من هلام الكولاجين في وسط قالب الأنسجة.
شطف الكتلة مع عازلة مناسبة واستكمال القالب بمحلول تثبيتي. احتضان للسماح لهذا المحلول باختراق الكرويات وربط البروتينات الخلوية. تساعد هذه الخطوة في الحفاظ على البنية الكروية للإجراء اللاحق. بعد ذلك ، استنشق المحلول التثبيتي.
ضع كتلة الجل الكروي في قالب نسيجي جديد يحتوي على طبقة رقيقة من وسط التضمين. قم بتراكبها بمزيد من وسيط التضمين لغمر الكتلة الكروية بالكامل. أخيرا ، اغمر القالب في حمام النيتروجين السائل لفترة قصيرة.
يمنع التجميد السريع تكوين بلورات جليدية أكبر داخل الكرويات. يساعد في الحفاظ على سلامة كروية دون التسبب في تلف ميكانيكي. بمجرد أن تصلب الطبقة المتوسطة المضمنة حول الكتلة الكروية ، قم بإزالة الكتلة المجمدة من القالب. قم بتخزين الكتلة الكروية المجمدة في درجات حرارة منخفضة لمزيد من التحليل النسيجي.
أولا ، استخدم ملقطا صغيرا لرفع كتلة هلام الكولاجين والكرويات من شريحة الغرفة. ثم ضع كتلة جل الكولاجين في قالب الأنسجة البلاستيكي. اشطف كتلة جل الكولاجين باستخدام 1X PBS لفترة وجيزة وثبتها بنسبة 4٪ PFA في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل كتلة جل الكولاجين ب 1.5 مل من 1X PBS على شاكر لمدة 15 دقيقة.
ضع طبقة رقيقة من مركب OCT في قاع قالب الأنسجة البلاستيكي الجديد. بعد ذلك ، ضع كتلة جل الكولاجين الثابتة والمغسولة فوق مركب OCT قبل ملء باقي القالب بمركب OCT بعناية. احتفظ بالقالب عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتجميد القالب على طبق بتري مقاس 100 ملم يطفو على النيتروجين السائل ، وقم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.