عزل الإكسوزوم: تقنية طرد مركزي فائق تعتمد على الكثافة باستخدام وسادة السكروز لفصل الإكسوسومات عن الوسائط المكيفة للخلايا المستزرعة

0 مشاهدات4:11 د • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إفراز الإكسوسومات - حويصلات بحجم نانو ومرتبطة بالغشاء تحمل جزيئات حيوية وظيفية - بنشاط بواسطة معظم أنواع الخلايا ويمكن عزلها من المواد الطافية لزراعة الخلايا في المختبر. لعزل الإكسوسومات ، أولا ، حصاد الوسائط الطافية أو التكييف من ثقافة الخلية ذات الأهمية. ستحتوي الوسائط التكييف على الإكسوسومات والبروتينات والحطام الخلوي والحويصلات.

الطرد المركزي الوسائط لحبيبات الحطام الخلوي. اجمع المادة الطافية المحتوية على الإكسوسوم وقم بتصفيتها من خلال مصافي الخلايا لإزالة الحويصلات الأكبر. انقل حجما معينا من الوسائط المفلترة إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، اخلطي التركيزات المناسبة من السكروز وأكسيد الديوتيريوم لتحضير وسادة السكروز - تدرج متقطع من السكروز.

أضف حجما معينا من محلول وسادة السكروز إلى الأنبوب المحتوي على الوسائط ؛ يشكل المحلول طبقة منفصلة في الأسفل. الآن ، قم بالطرد المركزي للأنبوب بسرعة عالية. تسهل وسادة السكروز هجرة الإكسوزومات من الوسائط إلى محلول السكروز مع الحفاظ على سلامة الإكسوزوم. تحتل ملوثات البروتين عالية الكثافة الواجهة بين محلول السكروز والوسائط.

انقل بعناية الجزء الأكبر من طبقة السكروز المحتوية على الإكسوسوم إلى أنبوب جديد مع مخزن مؤقت مناسب. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية للحصول على حبيبات من الإكسوسومات المنقاة. تخلص من المادة الطافية المحتوية على السكروز مع أي ملوثات بروتينية أعد تعليق حبيبات الإكسوسوم في المخزن المؤقت وخزنها في درجات حرارة منخفضة حتى الاستخدام الآخر.

لمسح الوسط المكيف الذي تم جمعه مسبقا ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. بعد تكرار خطوة الطرد المركزي هذه مع المادة الطافية المستردة ، استرجع المادة الطافية مرة أخرى وتخلص من الحبيبات.

بعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي للطافي المستعاد عند 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة و 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية وتخلص من الحبيبات. قم بتصفية المادة الطافية مرة واحدة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر متصل بحقنة سعة 20 مليلتر في أنبوب طرد مركزي جديد.

وفي الوقت نفسه ، لتحضير محلول السكروز بنسبة 25٪ في أكسيد الديوتيريوم ، قم بوزن 1.9 جرام من السكروز بدقة في أنبوب عالمي. ثم أضف أكسيد الديوتيريوم حتى يصل الوزن إلى 7.6 جرام. بعد ذلك ، املأ أنبوب الطرد المركزي الفائق ب 22.5 مل من الوسط المكيف الذي تم تطهيره مسبقا.

ضع ماصة زجاجية في الأنبوب. أضف 3 ملليلتر من محلول السكروز عبر الماصة بحيث يشكل المحلول طبقة منفصلة أسفل الوسط المكيف. ضع الأنبوب الذي يحتوي على محلول سكروز متوسط مكيف متعدد الطبقات بعناية في دلو الدوار المتأرجح.

قم بتثبيت الجرافة في الدوار. ضع الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بتدويره 100,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. اجمع 2 مل من طبقة السكروز من الأنبوب ، 1 مليلتر في المرة الواحدة ، باستخدام ماصة P1000 مع طرفها متصل بطرف سعة 10 ميكرولتر وأضفها إلى زجاجة طرد مركزي فائق تحتوي على 20 مل من PBS المصفى للغسيل.

ضع الأنبوب في دوار بزاوية ثابتة وقم بطرده عند 100,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات ب 400 ميكرولتر من PBS المصفى.

09:22

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:18

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:03

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:43

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:27

تنقية المجموعات السكانية الفرعية للحويصلات خارج الخلية: تقنية لتنقية المجموعات السكانية الفرعية للحويصلات خارج الخلية باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

11:38

طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:59

نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:59

إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:27

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:13

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 1 أغسطس 2026