موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:04 دقيقة • April 30th, 2023
تظهر الإكسوسومات - حويصلات غشائية مشتقة من الخلايا بحجم النانو - إمكانات كمركبات توصيل علاجية للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل مزدوج الشريطة.
بعد إطلاقه في سيتوبلازم الخلية المستهدفة ، يرتبط siRNA بمركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي. ثم يتعرف المركب المنشط على mRNA معين ويرتبط به ، وينظم سلبا تعبيره ويتوسط في إسكات الجينات.
لتغليف siRNA في الإكسوسومات ، أولا ، قم بتبريد كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد. بعد ذلك ، قم بخلط الإكسوسومات والحمض النووي الريبي المحدد في أنبوب بالنسبة المطلوبة باستخدام مخزن مؤقت مناسب للتثقيب الكهربائي. الآن ، انقل هذا الخليط إلى الكوفيت المبرد مسبقا.
أغلق الكوفيت وضعه في حامل الكوفيت الخاص بجهاز الثقب الكهربائي. قم بتدوير عجلة الدوران للتأكد من أن الكوفيت يتلامس مع أقطاب التثقيب الكهربائي. الآن ، قم بتشغيل برنامج التثقيب الكهربائي المحدد.
أثناء التثقيب الكهربائي ، تزعج النبضات الكهربائية طبقة الفوسفوليبيد الثنائية للإكسوسومات المعلقة في المخزن المؤقت الموصل. ينتج عن هذا تكوين مسام عابرة في غشاء الإكسوسوم ، مما يعزز انتشار siRNA في الحويصلة. يساعد المخزن المؤقت على منع تراكم siRNA.
بمجرد اكتمال التثقيب الكهربائي ، يتم إعادة إغلاق المسام ، مما يؤدي إلى محاصرة الحمض النووي الريبي بداخلها. أخيرا ، قم بإزالة الكوفيت من المثقب الكهربائي وانقل الخليط إلى أنبوب جديد. قم بتخزين الإكسوسومات المغلفة بالحمض النووي الريبي في درجات حرارة منخفضة حتى الاستخدام الآخر.
قبل البدء في التثقيب الكهربائي ، قم بتبريد كوفيت التثقيب الكهربائي مسبقا على الجليد لمدة 30 دقيقة. امزج 7 ميكروغرام من الإكسوسومات مع 0.33 ميكروغرام من siRNA في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف عازلة حامض الستريك لتحقيق حجم 150 ميكرولتر. أضف خليط exosome-siRNA إلى كوفيت التثقيب الكهربائي باستخدام ماصة بلاستيكية وقم بتغطية الكوفيت.
ضع الكوفيت في الاتجاه الصحيح في حامل الكوفيت الخاص بالمثقب الكهربائي وقم بتدوير عجلة الدوران للمثقب الكهربائي 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة. حدد البرنامج المطلوب واضغط على زر البدء لبدء التثقيب الكهربائي. ستشير الشاشة إلى نبض ناجح.
ثم أدر العجلة للخلف 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة وقم بإزالة الكوفيت. استخدم ماصة بلاستيكية لإزالة العينة من الكوفيت إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. احتفظ بالأنبوب على الثلج أو في الثلاجة قبل المعالجة الإضافية إذا لم يتم استخدامه على الفور.