شفط السوائل من كبيبات الفأر: طريقة لشفط السائل الكبيبي من الفأر باستخدام بزل دقيق بوساطة فوتونين

في الكلى ، تبدأ الكبيبة - وهي حزمة من الأوعية الدموية الصغيرة المحاطة بكبسولة بومان - بترشيح الدم وتطرد السائل الفضلي إلى مساحة بومان المحيطة. يساعد فحص محتويات السائل الكبيبي على فهم فسيولوجيا الكلى.

لشفط السائل الكبيبي ، قم بإعداد فأر مخدر مع كليته الخارجية جراحيا. الآن ، قم بحقن صبغة الفلورسنت ديكستران في الأوعية الدموية خلف مدار عين الفأر. تتحرك جزيئات الفلورسنت ديكستران عبر مجرى الدم وتصل إلى الكلى.

نظرا للوزن الجزيئي العالي للديكستران ، يتم الاحتفاظ بالصبغة الفلورية داخل الكبيبة ، مما يضفي عليها لونا أخضر. تحت المجهر ثنائي الفوتون ، والذي يسمح بتصور الهياكل العميقة الجذور ، حدد موقع كبيبة مناسبة للحصول على وصول كاف إلى السائل الكبيبي.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة طرف ماصة دقيقة مطلية بجسيمات نانوية فلورية حمراء مع المحور الجانبي للكلى. باستخدام معالج دقيق ، قم بدفع طرف الماصة لاختراق الكلى. عندما يصل الطرف إلى الكبيبة المستهدفة ، اضبط معدل الشفط المطلوب لشفط السائل الكبيبي من مساحة بومان.

يشير عدم وجود مضان أخضر داخل طرف الماصة الحمراء إلى قلة النزيف ويؤكد نجاح شفط السائل الكبيبي. بعد ذلك ، اسحب الماصة وقم بتخزين السائل في مخزن مؤقت مناسب لمزيد من التحليل.

بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، ضع مرهما على العينين واستخدم شريطا لتثبيت أطراف الفأر البالغ الذي يتراوح وزنه بين 20 و 25 جراما. استخدمي كريما لإزالة الشعر لإزالة كل الشعر الموجود على الجانب الأيسر من ، واستخدمي الطحال لتحديد موقع الكلية اليسرى من خلال الجلد على الجانب الظهري والذيلي من الطحال.

قم بعمل شق 0.5 سم في الجلد ، متبوعا بشق أصغر في الصفاق ، كبير بما يكفي لدفع الكلى من خلالها. قم بثق الكلى بضغط برفق وضع شكل مثبت الكلى من البولي سيلوكسان حول الأنسجة. قم بمحاذاة الكلية بالفاصل بحيث يمتد السطح الجانبي للكلية إلى ما وراء المثبت بحوالي 1 ملليمتر وقم بتثبيت الكلى بالشكل باستخدام مادة لاصقة سيانواكريلات. قم بلصق لوحة رأس على شكل المثبت وقم بتركيب لوحة الرأس على قضبان التثبيت على لوحة القاعدة.

بعد ذلك ، املأ البئر في دعامة البولي سيلوكسان بمحلول 1٪ من الاغاروز واحتفظ بغطاء 10 ملم أعلى النموذج حتى يصبح الاغاروز متماسكا. أغلق الغطاء على لوحة الرأس بالغراء وقم بإنشاء حلقة حول الغطاء باستخدام الأسمنت الأسنان. بعد ذلك ، قم بحقن 100 إلى 150 ميكرولتر من FITC-dextern بشكل مداري رجعي وحرك الماوس ولوحة التثبيت بسرعة إلى مرحلة المجهر ثنائي الفوتون.

بعد التركيز يدويا على سطح الكلى ، قم بالتبديل إلى وضع الفوتون ثنائي الفوتون غير الماسح واستكشف نافذة التصوير لتحديد موقع الكبيبة المستهدفة التي تزيد عن 30 ميكرومتر أسفل الغطاء وأقل من 400 ميكرومتر من كبسولة الكلى الجانبية. سجل المسافة الجانبية والرأسية إلى الكبيبة المستهدفة. بعد ذلك ، قم بتسجيل إحداثيات المرحلة x و y و z للكبيبة ، وأخيرا ، ارفع النقطة المحورية الموضوعية حوالي 1 ملليمتر في عمود الماء دون تغيير إحداثيات المرحلة x و y.

ادفع طرف الماصة إلى عمود الماء وقم بتشغيل إثارة DAPI. حرك الماصة في البعدين X و Y إلى نقطة التألق الأقصى للطرف. سيكون هذا هو مركز الهدف. قم بتغيير إعداد الإثارة إلى بروتين الفلورسنت الأحمر وتصور الماصة باستخدام العين للسماح بالتمركز الدقيق في رؤية العين.

ارجع إلى الفوتونين للعثور على الماصة أسفل عرض الفوتونين المباشر وضع الطرف بدقة في وسط الصورة. هذا هو موقف التسجيل. بعد ذلك، احفظ صورة للماصة وسجل المرحلة وإحداثيات وحدة التحكم في الماصة الدقيقة. قم بإزالة الماصة من عمود الماء في المحور x دون تحريك المحورين y وz، وانقل الماصة Z إلى إحداثيات الكبيبة Z المستهدفة وحافة الكلى.

لاحظ المرحلة X واحسب ماصة حافة الكلى X باستخدام الإزاحة من مرحلة التسجيل ، X. قم بزيادة المرحلة X لتحريك المرحلة باتجاه الماصة حتى تصبح حافة الكلية بعيدة عن يسار الشاشة بينما تظل مرئية. ادفع الماصة بسرعة إلى حوالي 100 ميكرومتر بعيدا عن ماصة حافة الكلى X كما تم حسابها للتو. قم بزيادة الكسب الأحمر وابدأ في دفع طرف الماصة ببطء إلى حافة الكلى تحت التصوير المباشر ثنائي الفوتون أثناء مراقبة الرسم البياني للبكسل الأحمر.

قم بدفع الماصة في المحور x ببطء إلى الماصة الكبيبية المستهدفة X، مع مراقبة المرحلة X. عند الوصول إلى الكبيبة ، قم بتوثيق الموضع باستخدام مكدس Z. مع وضع الماصة في موضعها، اضبط المضخة الدقيقة على حقن 100 نانولتر من البيرفلوروديكالين على مدار دقيقتين لضمان سالكية الماصة وتقليل الخلط الناتج عن انسداد الماصة أثناء الدخول. بعد 4 إلى 6 دقائق من الترشيح ، اضبط المضخة الدقيقة على شفط ما يصل إلى 300 نانولتر بمعدل يصل إلى 50 نانولتر في الدقيقة.