نموذج الخلايا الجذعية للورم الدبقي الموسوم بعلامة لوسيفيراز: طريقة بوساطة فيروس العدسي لإعداد الخلايا الجذعية للورم الدبقي الموسومة بعلامة لوسيفيراز للدراسات العلاجية في المختبر

الخلايا الجذعية للورم الدبقي هي مجموعة سكانية فرعية من الورم الدبقي - سرطان الخلايا الدبقية في الدماغ.

يساعد وضع علامات على هذه GSCs بإنزيمات مضيئة بيولوجيا مثل لوسيفيراز في إنشاء فحوصات تصوير عالية الإنتاجية لفحص الأدوية.

لتحضير GSCs الموسومة بعلامة لوسيفيراز ، ابدأ بثقافة GSCs في وسط نمو مناسب.

الطرد المركزي للثقافة للحصول على حبيبات الخلية وإزالة المادة الطافية.

أضف إنزيمات هضمية مناسبة إلى الحبيبات. تعمل هذه الإنزيمات على فصل مجموعات الخلايا وتحلل أي آثار للنسيج الضام للحصول على تعليق أحادي الخلية.

الآن ، قم بالطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في وسط جديد.

بعد ذلك ، قم بزرع التركيز المطلوب للخلايا في لوحة الاستزراع.

احتضان الثقافة والسماح للخلايا بالالتصاق بلوحة الثقافة.

بعد ذلك ، أضف العيار المطلوب لبناء الجين المحتوي على الفيروس لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز باللوسيفيراز أو EGFP واحتضانه.

يتفاعل الفيروس مع المستقبلات السطحية ل GSCs ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي الريبي الفيروسي الذي يحتوي على لوسيفيراز-EGFP. تحفز الإنزيمات الخلوية النسخ العكسي للحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي مزدوج الشريطة ودمجها في جينوم GSCs.

عند تصورها تحت المجهر الفلوري ، تظهر الخلايا التي تعبر عن اللوسيفيراز باللون الأخضر بسبب التألق المنبعث من EGFP.

ابدأ بجمع الخلايا الجذعية للورم الدبقي أو الخلايا الجذعية من وسط المزرعة وطردها عند 70 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، هضم الخلايا ب accutase لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية.

باستخدام طرف سعة 200 ميكرولتر ، قم بعمل ماصة الخلايا بشكل متكرر لفصل حبيبات الخلية وإعادة تعليقها. أضف GSCs بكثافة 200,000 خلية في 1 مليلتر من وسط الاستزراع في كل بئر من صفيحة استزراع 12 بئرا واحتضانها طوال الليل.

في اليوم التالي ، أضف 30 ميكرولترا من مادة طافية فيروس لوسيفيراز EGFP في كل بئر من اللوحة. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1,000 × جم لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية واحتضانها طوال الليل.

في اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود في الآبار عن طريق جمع GSCs ، وطرد مركزي لها ، وإزالة المادة الطافية ، وتعليقها في وسط جديد ، وإعادة طلاءها. استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.

راقب اللوحة تحت المجهر الفلوري وتأكد من ظهور الخلايا الإيجابية ل GFP.