استخراج الببتيدات الموجود في Ubiquitinylated على أساس التقارب المناعي: تقنية لاستخراج الببتيدات الموسومة باليوبيكويتين بشكل انتقائي من كسور الببتيد المنقاة

يتميز انتشار البروتينات في كل مكان بإضافة اليوبيكويتين - وهو بروتين صغير تنظيمي - عبر بقايا ثنائي جلايسين إلى بقايا اللايسين لبروتين الركيزة. هذا يولد رابطا بين اللايسين والجلايسين والجلايسين بين بروتين الركيزة واليوبيكويتين.

لعزل الببتيدات الموسومة باليوبيكويتين ، ابدأ بتناول مزيج الببتيد.

عالج هذه الببتيدات بكوكتيل إنزيم نوكلياز داخلي. أثناء العلاج ، تشق الإنزيمات Lys-C و trypsin بكفاءة الببتيدات الموجودة في كل مكان في بقايا الأرجينين ، مما ينتج عنه شظايا الببتيد التي تحتوي على شكل ثنائي جلايسين مميز.

أضف شظايا الببتيد هذه إلى ملاط من حبات الهيدروجيل المترافقة بالأجسام المضادة.

تحتوي هذه الأجسام المضادة على موقع التعرف على ثنائي جلايسين ، والذي يرتبط حصريا بالببتيدات الموجودة في كل مكان ، ويشكل مركب حبة الببتيد.

جهاز طرد مركزي لتكوير مجمعات حبة الببتيد في كل مكان. قم بإزالة المادة الطافية غير المنضمة المحتوية على الببتيد في كل مكان.

قم بتحميل المجمعات على مجموعة مرشح. جهاز طرد مركزي لإزالة المخزن المؤقت واحتجاز الخرز المترافق بالببتيد.

أضف كاشفا محمضا يخفض درجة الحموضة ، مما يتسبب في فك ارتباط الببتيدات من الخرز.

استرجع الببتيدات الحرة من المرشح. قم بتحميلها على مرشح جديد بمصفوفة كارهة للماء. تحتفظ الببتيدات في المصفوفة بينما يتم غسل الأملاح الحمضية.

باستخدام مذيب مناسب ، افصل الببتيدات.

انقل الببتيدات الموجودة في كل مكان إلى أنبوب جديد وجففها لإزالة أي آثار للمذيب.

يتم تقسيم دفعة واحدة من الأجسام المضادة لبقايا اليوبيكويتين المقترنة بملاط حبة الاغاروز بالبروتين A إلى ستة أجزاء متساوية. قم بإذابة الكسور الببتيدية الثلاثة وفقا لتوجيهات المخطوطة وقم بتدوير الحطام.

أضف المواد الطافية للأجزاء الثلاثة إلى ملاط الخرز مع الاحتفاظ بالأجزاء الثلاثة الأخرى على الجليد واحتضانها لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية على وحدة مدورة.

ثم قم بتدوير الخرز. انقل المادة الطافية إلى مجموعة جديدة من الخرز وكرر الحضانة مع كسور ملاط الخرز الثلاثة المتبقية.

قم بتخزين المواد الطافية لتحليل البروتيوم العالمي اللاحق وانقل الخرزات إلى أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر مزودة بسدادة مرشح GF/F.

ضع الأطراف في أنابيب سعة 1.5 مليلتر مزودة بمحول طرف جهاز طرد مركزي واغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت IAP المثلج ، متبوعا بثلاث غسلات بالماء النقي المثلج.

قم بتدوير الأعمدة عند 200 × جم لمدة دقيقتين بين الغسلات ، مع التأكد من عدم ترك العمود يجف. بعد الغسيل النهائي ، قم بمسح الببتيدات بدورتين من 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA. قم بتحلية الببتيدات بطرف المرحلة C18 وجففها باستخدام الطرد المركزي الفراغي.

• Ubiquitination – Addition of ubiquitin to a substrate protein via a lysine-glycine-glycine linkage.
• Ubiquitin Lysine Linkage – A crucial bond between ubiquitin and the substrate protein.
• Ubiquitinylated peptides – Peptide fragments containing a signature di-glycine motif due to ubiquitination.
• Purified peptides – Peptides that have been isolated and rid of contaminants.
• Ubiquitin Affinity Matrix – A medium used for binding and isolating ubiquitinylated peptides.

• Introduce ubiquitination – the process of adding ubiquitin to substrate proteins (e.g., ubiquitin).
• Outline key peptides – explaining the process of creating peptide fragments with unique motifs (e.g., ubiquitin lysine linkage).
• Explain peptide purification – a brief walkthrough of the isolation and purification of peptides process.
• Connect to experiment – Highlight how this information pertains to the experimental process of using the PT-141 peptide.

• What is ubiquitination and how does it involve lysine-glycine-glycine linkage?
• How are ubiquitinylated peptides created and isolated?
• What is the role of ubiquitin affinity matrix in the purification process?

• Describe practical applications – Use in drug discovery and various research analysis (e.g., PT-141 peptide).
• Identify Industry impact – Benefits in pharmaceutical and biotechnological sectors.
• Highlight Societal importance – Potential to boost health sector by leading to novel treatment strategies.
• Link to scientific advancements – Contribution to a deeper understanding of protein behavior and function.