موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:37 دقيقة • April 30th, 2023
تطلق الخلايا الدبقية الصغيرة وسطاء مناعيين على شكل حويصلات خارج الخلية أو EVs ، بما في ذلك أجسام موت الخلايا المبرمج الأكبر حجما والحويصلات الصغيرة الحجم ، في وسط النمو في المختبر.
لعزل المركبات الكهربائية ، ابدأ بأخذ وسائط مكيفة للخلايا الدبقية الصغيرة. تحتوي وسائط الثقافة هذه على خلايا دبقية صغيرة جنبا إلى جنب مع المركبات الكهربائية التي تم إصدارها. الطرد المركزي الوسائط لحبيبات الخلايا.
اجمع المادة الطافية التي تحتوي على المركبات الكهربائية والحطام ومجاميع البروتين في أنبوب جديد. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة الحطام الخلوي والأجسام المتبرمجة الكبيرة.
انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية.
تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على وسائط مستهلكة وأعد تعليق حبيبات المركبات الكهربائية والبروتين في المخزن المؤقت المطلوب.
فيالوقت نفسه ، خذ عمودا كروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم مع مرشح مناسب في قاعدته.
قم بتعبئة العمود بإحكام بمصفوفة ترشيح هلامية تتكون من حبات هلامية كروية تشكل منخل مسامي بحجم مسام محدد.
قم بتحميل تعليق EV والبروتين الإجمالي أعلى المرحلة الثابتة.
عندما يمر التعليق عبر العمود ، تتحرك المركبات الكهربائية الأكبر حجما عبر المساحات بين الجسيمات بين حبات الهلام ، وتسير في مسار أقصر. في المقابل ، تنتقل مجاميع البروتين الأصغر حجما إلى المسام ، متبعة مسارا أطول.
وبالتالي ، تخرج المركبات الكهربائية أولا من العمود.
اجمع الكسور التي تحتوي على المركبات الكهربائية واستخدمها لمزيد من التحليل.
انقل وسط الاستزراع المكيف من الخلايا الدبقية الصغيرة أو مزارع البلاعم إلى أنبوب مخروطي الشكل وقم بطرده عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق لحبيبات الخلايا. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة أخرى للتخلص من الأجسام موت الخلايا المبرمج.
ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي كربونات سعة 10.4 مل. ضع الأنبوب في دوار 70.1 Ti وقم بجهاز الطرد المركزي الفائق عند 100,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية لحبيبات المركبات الكهربائية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS المصفى بحجم 0.2 ميكرومتر.
لعزل المركبات الكهربائية ، قم بإعداد عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم محلي الصنع عن طريق غسل وتعقيم عمود كروماتوغرافيا زجاجي ووضع مرشح 60 ميكرومتر في الأسفل. قم بتكديس العمود بمصفوفة قاعدة ترشيح هلام الاغاروز المتشابكة لإنشاء مرحلة ثابتة بقطر 0.6 سم وارتفاع 20 سم.
ثم اشطف المرحلة ب 50 مل من PBS المصفى بحجم 0.2 ميكرومتر. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين العمود عند 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا. ضع حبيبات EV المعلقة أعلى المرحلة الثابتة واجمع 20 كسرا متسلسلا من 250 ميكرولتر مع الاستمرار في إضافة PBS إلى الجزء العلوي من المرحلة الثابتة. يمكن تخزين الكسور عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.