استخراج البروتينات المرتبطة بالحويصلات خارج الخلية المستند إلى SDS-PAGE: إجراء لاستخراج البروتينات من المركبات الكهربائية وإعدادها للهضم داخل الهلام

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 3:22 د • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للبدء ، خذ أنبوبا يحتوي على حويصلات خارج الخلية سليمة أو EVs.

قم بتعليق المركبات الكهربائية في الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للتحلل وصوتنة العينة. يعمل هذا العلاج على تحلل غشاء EV وقص المادة الوراثية ، وإطلاق البروتينات في المخزن المؤقت.

أجهزة الطرد المركزي لتكوير حطام الخلية والمواد الوراثية المنفصمة. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات مختلفة.

أضف صبغة تحميل إلى مستخلص البروتين وقم بتشغيلها على جل SDS-PAGE.

انقع الجل في محلول تلطيخ للسماح لجزيئات الصبغة بربط البروتينات. حدد موقع الشريط الملون الذي يحتوي على البروتين المطلوب واستئصاله.

قطع الشريط الملون إلى قطع صغيرة لتحسين إمكانية وصول البروتينات إلى الإنزيمات في الخطوات اللاحقة. انقل هذه القطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

أضف محلول إزالة البقع الذي يزيل صبغة التلوين. قم بإزالة محلول إزالة البقع المستهلك.

أضف محلول اختزال. احتضان للسماح للعامل المختزل بشق روابط ثاني كبريتيد في البروتين ، مما يؤدي إلى تعريض مجموعات السلفهيدريل الحرة.

عالج البروتينات المخفضة بمحلول مؤلكل. ترتبط مجموعات الألكيل بمجموعات السلفهيدريل الحرة ، مما يحافظ على البروتين مفتوحا.

تخلص من المحلول الزائد واغسل القطع بمحلول مجفف لإزالة الكاشف المؤلكل. جفف الجل تماما.

قطع الجل جاهزة الآن لمزيد من التحليل البروتيني.

لاستخراج البروتين ، امزج 50 ميكرولترا من عازلة RIPA مع عينة EV لمدة 5 دقائق على الثلج. قم بصوت العينة ثلاث مرات عند 500 واط و 20 كيلو هرتز لمدة 5 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة الحطام الحويصلي عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.

بعد عزل البروتينات ، قم بإجراء هجرة البروتين في هلام التكديس لجل بولي أكريلاميد بنسبة 12٪. ثبت البروتينات في الجل باستخدام Coomassie blue لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم باستئصال كل قطعة جل ملونة وتقطيعها إلى قطع صغيرة.

ضع قطع الجل في سلسلة من الغسالات المتتالية كما هو موضح في المخطوطة. ثم جففها تماما باستخدام مكثف فراغ. بعد التجفيف ، قم بإجراء تقليل البروتين باستخدام 100 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمولار التي تحتوي على 10 ملليمولار ثنائي ثيوثريتول لمدة ساعة واحدة عند 56 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإجراء ألكلة البروتين باستخدام 100 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمولار التي تحتوي على 50 ملليمولار يودوأسيتاميد لمدة 45 دقيقة في الظلام. اغسل قطع الجل وفقا لتوجيهات المخطوطة وجففها تماما على مكثف الفراغ.

10:36

عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:15

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:07

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:03

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:15

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:09

توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:33

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:34

تحديد الببتيدات للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الضامة المشتقة من نخاع العظام

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:28

العزلة القائمة على التقارب الكيميائي للحويصلات خارج الخلية من السوائل الحيوية لتحليل البروتيوميات وعلم الفوسفوبروتيوميكس

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:30

عزل وتوصيف وتحليل البروتينات للحويصلات خارج الخلية المشتقة من البلازما لاكتشاف المؤشرات الحيوية للقلب والأوعية الدموية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 1 أغسطس 2026