استخراج البروتينات المرتبطة بالحويصلات خارج الخلية المستند إلى SDS-PAGE: إجراء لاستخراج البروتينات من المركبات الكهربائية وإعدادها للهضم داخل الهلام
موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:22 دقيقة • April 30th, 2023
للبدء ، خذ أنبوبا يحتوي على حويصلات خارج الخلية سليمة أو EVs.
قم بتعليق المركبات الكهربائية في الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للتحلل وصوتنة العينة. يعمل هذا العلاج على تحلل غشاء EV وقص المادة الوراثية ، وإطلاق البروتينات في المخزن المؤقت.
أجهزة الطرد المركزي لتكوير حطام الخلية والمواد الوراثية المنفصمة. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات مختلفة.
أضف صبغة تحميل إلى مستخلص البروتين وقم بتشغيلها على جل SDS-PAGE.
انقع الجل في محلول تلطيخ للسماح لجزيئات الصبغة بربط البروتينات. حدد موقع الشريط الملون الذي يحتوي على البروتين المطلوب واستئصاله.
قطع الشريط الملون إلى قطع صغيرة لتحسين إمكانية وصول البروتينات إلى الإنزيمات في الخطوات اللاحقة. انقل هذه القطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
أضف محلول إزالة البقع الذي يزيل صبغة التلوين. قم بإزالة محلول إزالة البقع المستهلك.
أضف محلول اختزال. احتضان للسماح للعامل المختزل بشق روابط ثاني كبريتيد في البروتين ، مما يؤدي إلى تعريض مجموعات السلفهيدريل الحرة.
عالج البروتينات المخفضة بمحلول مؤلكل. ترتبط مجموعات الألكيل بمجموعات السلفهيدريل الحرة ، مما يحافظ على البروتين مفتوحا.
تخلص من المحلول الزائد واغسل القطع بمحلول مجفف لإزالة الكاشف المؤلكل. جفف الجل تماما.
قطع الجل جاهزة الآن لمزيد من التحليل البروتيني.
لاستخراج البروتين ، امزج 50 ميكرولترا من ع
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية