موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:22 دقيقة • April 30th, 2023
للبدء ، خذ أنبوبا يحتوي على حويصلات خارج الخلية سليمة أو EVs.
قم بتعليق المركبات الكهربائية في الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للتحلل وصوتنة العينة. يعمل هذا العلاج على تحلل غشاء EV وقص المادة الوراثية ، وإطلاق البروتينات في المخزن المؤقت.
أجهزة الطرد المركزي لتكوير حطام الخلية والمواد الوراثية المنفصمة. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات مختلفة.
أضف صبغة تحميل إلى مستخلص البروتين وقم بتشغيلها على جل SDS-PAGE.
انقع الجل في محلول تلطيخ للسماح لجزيئات الصبغة بربط البروتينات. حدد موقع الشريط الملون الذي يحتوي على البروتين المطلوب واستئصاله.
قطع الشريط الملون إلى قطع صغيرة لتحسين إمكانية وصول البروتينات إلى الإنزيمات في الخطوات اللاحقة. انقل هذه القطع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
أضف محلول إزالة البقع الذي يزيل صبغة التلوين. قم بإزالة محلول إزالة البقع المستهلك.
أضف محلول اختزال. احتضان للسماح للعامل المختزل بشق روابط ثاني كبريتيد في البروتين ، مما يؤدي إلى تعريض مجموعات السلفهيدريل الحرة.
عالج البروتينات المخفضة بمحلول مؤلكل. ترتبط مجموعات الألكيل بمجموعات السلفهيدريل الحرة ، مما يحافظ على البروتين مفتوحا.
تخلص من المحلول الزائد واغسل القطع بمحلول مجفف لإزالة الكاشف المؤلكل. جفف الجل تماما.
قطع الجل جاهزة الآن لمزيد من التحليل البروتيني.
لاستخراج البروتين ، امزج 50 ميكرولترا من عازلة RIPA مع عينة EV لمدة 5 دقائق على الثلج. قم بصوت العينة ثلاث مرات عند 500 واط و 20 كيلو هرتز لمدة 5 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة الحطام الحويصلي عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
بعد عزل البروتينات ، قم بإجراء هجرة البروتين في هلام التكديس لجل بولي أكريلاميد بنسبة 12٪. ثبت البروتينات في الجل باستخدام Coomassie blue لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم باستئصال كل قطعة جل ملونة وتقطيعها إلى قطع صغيرة.
ضع قطع الجل في سلسلة من الغسالات المتتالية كما هو موضح في المخطوطة. ثم جففها تماما باستخدام مكثف فراغ. بعد التجفيف ، قم بإجراء تقليل البروتين باستخدام 100 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمولار التي تحتوي على 10 ملليمولار ثنائي ثيوثريتول لمدة ساعة واحدة عند 56 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإجراء ألكلة البروتين باستخدام 100 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمولار التي تحتوي على 50 ملليمولار يودوأسيتاميد لمدة 45 دقيقة في الظلام. اغسل قطع الجل وفقا لتوجيهات المخطوطة وجففها تماما على مكثف الفراغ.