موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 4:02 دقيقة • April 30th, 2023
المجالات العصبية عبارة عن مجاميع كروية غير ملتصقة من الخلايا السليفة العصبية أو الشخصيات غير القابلة للعب.
عند طلاءها في ظل ظروف ثقافة ملتصقة محددة ، قد تهاجر الشخصيات غير القابلة للعب تلقائيا من الغلاف العصبي.
لتقييم الاستجابة المهاجرة لغير القابلة للعب ، أولا ، قم بإعداد تعليق NPC بالكثافة المرغوبة في وسط مناسب.
بعد ذلك ، قم بزرع معلق الخلية في صفيحة ثقافة تحتوي على وسائط واحتضنها.
تدعم عوامل النمو المحددة في وسائل الإعلام تكاثر الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود ركيزة طلاء يحافظ على الخلايا معلقة في الوسائط ، مما يسهل عليها تكوين مجاميع خلايا ثلاثية الأبعاد تسمى المجالات العصبية.
عند الوصول إلى الحجم المطلوب ، اجمع المجالات العصبية.
جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق حبيبات الغلاف العصبي في الوسائط المخففة.
بعد ذلك ، ضع تعليق الغلاف العصبي في صفيحة مغلفة بمصفوفة خارج الخلية تحتوي على وسائط مخففة واحتضنها.
أثناء الثقافة ، تلتصق المجالات العصبية بالمصفوفة خارج الخلية.
بمرور الوقت ، نظرا لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، يبدأ عدد قليل من الشخصيات غير القابلة للعب في الهجرة بعيدا عن قلب الغلاف العصبي.
الآن ، قم بإزالة الوسائط وإصلاح الخلايا.
التقط صورا على تباين الطور للمجالات العصبية التي تعرض هجرة الخلايا.
باستخدام برنامج مناسب ، قم بقياس مساحة الغلاف العصبي الكلي وكتلة الخلية الداخلية.
أخيرا ، اطرح مساحة كتلة الخلية الداخلية من إجمالي مساحة الغلاف العصبي لحساب متوسط هجرة NPC من الغلاف العصبي.
لتشكيل الغلاف العصبي ، قم بوضع ماصة 1 مليلتر من وسائط التمدد بنسبة 100٪ في طبق 35 ملم بدون أي ركيزة طلاء. بعد ذلك ، أضف مليون خلية سلائف عصبية في كل من هذه الألواح واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة.
لتحضير اللوحة لهجرة الغلاف العصبي ، قم بإذابة كميات الجل المقلدة ECM في 6 ملليلتر من وسط التمدد بنسبة 30٪. أضف 1 مليلتر من الجل المقلد ECM مع وسط تمدد بنسبة 30٪ في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
لصفيحة المجالات العصبية ، استخدم ماصة لجمع الخلايا الموجودة في الوسط من الطبق الذي يبلغ طوله 35 ملم ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل. ثم قم بتدوير الأنبوب عند 100 × جم لتكسير المجالات العصبية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 1 إلى 3 ملليلتر من وسط التمدد الدافئ مسبقا بنسبة 30٪.
بعد ذلك ، قم بإدخال 200 ميكرولتر من المجالات العصبية المعلقة في الصفيحة المكونة من 6 آبار تحتوي على الجل المقلد ECM مع وسط تمدد بنسبة 30٪ وهز اللوحة. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بشفط الجل المقلد ECM بوسط تمدد 30٪ ثم قم بإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد.
لتحليل المجالات العصبية، التقط الصور باستخدام إعدادات تباين الطور بتكبير 10X. استخدم برنامج NIH ImageJ لقياس متوسط هجرة المجالات العصبية. في ImageJ ، استخدم أداة الخط اليدوي لتتبع المحيط الخارجي للغلاف العصبي.
بعد ذلك ، استخدم وظيفة القياس لحساب مساحة التتبع وتتبع كتلة الخلية الداخلية للكرة. اطرح كتلة الخلية الداخلية من إجمالي مساحة الغلاف العصبي لتحديد متوسط الهجرة.