لماذا تسبق عملية الطرد المركزي منخفضة السرعة خطوات الطرد المركزي عالية السرعة في عزل الحويصلات خارج الخلوية (EV)؟

يؤدي الطرد المركزي منخفض السرعة عند 500 x g إلى تجميع الخلايا وشظايا الأنسجة في كتلة راسبة مع إبقاء الحويصلات خارج الخلوية في السائل الطافي، مما يسمح بإزالة الحطام الأولي دون فقدان الحويصلات خارج الخلوية. وتعمل هذه الخطوة على تنقية المزيج المتجانس قبل إجراء المزيد من عمليات التنقية، مما يحسن نقاء مجموعات الحويصلات خارج الخلوية في المراحل اللاحقة. وهي ضرورية لإزالة الملوثات الكبيرة التي قد تتدخل في خطوات الطرد المركزي والترشيح اللاحقة.

كيف يساهم الترشيح عبر مرشح بمسامية 0.45 ميكرومتر في تنقية الحويصلات خارج الخلوية (EVs)؟

تعمل عملية الترشيح على إزالة الأجسام الموتة المتبقية والحويصلات الأكبر حجماً التي لم تترسب خلال خطوات الطرد المركزي السابقة، مما يؤدي إلى إثراء مجموعة الحويصلات خارج الخلوية (EV) صغيرة الحجم. تضمن هذه الخطوة انتقال الحويصلات خارج الخلوية التي يقل حجمها عن 0.45 µm فقط إلى مرحلة الطرد المركزي الفائق، مما يقلل من التلوث بالبقايا الأكبر حجماً. ويعزز ذلك من خصوصية راسب الحويصلات خارج الخلوية النهائي الذي يتم الحصول عليه بعد الطرد المركزي بسرعة 100,000 x g.

ما الغرض من إعادة تعليق راسب الحويصلات خارج الخلوية (EV) في محلول سكروز بتركيز 0.25 مولار؟

يخلق محلول السكروز بيئة متساوية التوتر تساعد في الحفاظ على شكل الحويصلات خارج الخلوية (EV) وسلامتها الهيكلية بعد عملية الطرد المركزي الفائق. وهذا يمنع الصدمة الاسموزية التي قد تؤدي إلى تلف الحويصلات أثناء التخزين أو المناولة. ويعد الحفاظ على سلامة الحويصلات خارج الخلوية أمراً بالغ الأهمية لإجراء المقايسات الوظيفية اللاحقة والتوصيف الدقيق لمجموعات الحويصلات.

لماذا من الضروري تخزين معلق الحويصلات خارج الخلوية (EV) عند درجة حرارة 4 درجة مئوية؟

يحافظ التخزين عند 4°C على استقرار الحويصلات خارج الخلوية (EV) ويمنع تحللها أو تكتلها لحين استخدامها في التطبيقات اللاحقة. تحافظ درجة الحرارة هذه على سلامة الحويصلات دون الحاجة إلى التجميد، والذي قد يؤثر سلباً على بنية الغشاء. كما يدعم ذلك قابلية تكرار النتائج عبر التجارب من خلال توفير تحضير مستقر ومتسق من الحويصلات خارج الخلوية.

كيف يؤدي التفكيك الميكانيكي باستخدام مجانس دونس (Dounce homogenizer) إلى تحسين إنتاجية الحويصلات خارج الخلوية (EV) من الأنسجة؟

تؤدي حوالي 30 ضربة بطيئة باستخدام مجانس Dounce واسع الملاءمة إلى تفكيك الأنسجة بلطف بعد فترة التحضين، مما يؤدي إلى تحرير الخلايا والحويصلات خارج الخلوية في المحلول المنظم. وتكمل هذه الخطوة الميكانيكية عملية التفكيك الإنزيمي عن طريق تكسير بنية النسيج دون تعرضها لقوى قص مفرطة قد تؤدي إلى تلف الحويصلات خارج الخلوية (EVs). كما تضمن هذه العملية التحرير الفعال للحويصلات خارج الخلوية من المساحة الخلالية مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية من أجل التحليلات اللاحقة.

استخراج الحويصلة خارج الخلية: تقنية لعزل الحويصلات خارج الخلية من عينات الأنسجة الكاملة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 4:13 د • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأنسجة الكاملة ، تطلق الخلايا الحويصلات خارج الخلية أو المركبات الكهربائية في السائل الخلالي. وتشمل هذه الأجسام موت الخلايا المبرمج ، والحويصلات الدقيقة ، والإكسوسومات. تلعب المركبات الكهربائية دورا مهما في الحفاظ على الاتصال من خلية إلى خلية.

لاستخراج المركبات الكهربائية ، ابدأ بأخذ عينة كاملة من الأنسجة.

عالج الأنسجة بمحلول انفصال مناسب. تعمل مكونات المخزن المؤقت للتفكك على تفكيك المصفوفة خارج الخلية الموجودة في الأنسجة ، مما يؤدي في النهاية إلى فك الخلايا.

انقل المعلق إلى الخالط وقم بتعطيل الأنسجة ميكانيكيا لفصلها وتحرير الخلايا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي المتجانس بسرعة منخفضة لتكوير الخلايا وشظايا الأنسجة بينما تظل المركبات الكهربائية في المادة الطافية.

خذ المادة الطافية في أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي بسرعة عالية لتكوير معظم الأجسام المتبرمج الأكبر حجما ، مما يترك المركبات الكهربائية الأصغر حجما في المادة الطافية.

اجمع المادة الطافية المحتوية على EV في حقنة. قم بتصفية المكونات لإزالة أي أجسام موت الخلايا المبرمج المتبقية وجمع مجموعات المركبات الكهربائية الصغيرة الحجم.

جهاز الطرد المركزي للمرشح للحصول على المركبات الكهربائية في الحبيبات. تخلص من المخزن المؤقت المتبقي وأعد تعليق حبيبات EV في محلول السكروز. يخلق هذا الحل بيئة متساوية التوتر للمركبات الكهربائية للاحتفاظ بمورفولوجيتها.

الآن ، قم بتخزين تعليق EV عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.

للبدء ، قم بإعداد 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتفكك في Hibernate-E Medium لكل 0.4 إلى 1.0 جرام من الأنسجة. أضف أنسجة كاملة طازجة أو مجمدة إلى المخزن المؤقت في أنبوب سعة 50 مليلتر واحتضنه في حمام مائي دافئ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف مثبطات البروتياز والفوسفاتيز للحصول على تركيز نهائي 1x في المخزن المؤقت للتفكك. صب المحلول مع الأنسجة في الخالط Dounce فضفاض. استخدم ما يقرب من 30 ضربة بطيئة لكل عينة لفصل الأنسجة برفق.

ثم انقل الأنسجة المنفصلة والمحلول العازل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لتكسير الخلايا وشظايا الأنسجة الليفية أو المتماسكة المتبقية.

انقل المواد الطافية إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق للحبيبات والتخلص من الحطام الخلوي الكبير.

انقل هذا المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة لحبيبات أي حويصلات أكبر غير مرغوب فيها أو أجسام موت الخلايا المبرمج الصغيرة. صب المادة الطافية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي فائق نظيف سعة 12 مل.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي الفائق للعينة عند 100,000 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين لبيليه المركبات الكهربائية الصغيرة. صب المادة الطافية واترك أنابيب الطرد المركزي الفائقة مقلوبة لمدة 5 إلى 10 دقائق ، مع النقر بشكل متكرر لإزالة أي سائل متبقي على جوانب الأنابيب.

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 15 أغسطس 2026

استخراج الحويصلة خارج الخلية: تقنية لعزل الحويصلات خارج الخلية من عينات الأنسجة الكاملة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي

نظرة عامة

مكونات الدراسة الرئيسية

مجال العلوم

خلفية علمية

الغرض من الدراسة

الطرق المستخدمة

النتائج الرئيسية

الاستنتاجات

الأسئلة الشائعة

الأهمية الصناعية التنفيذية

التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية

الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف

الفحص وتطوير المقايسة

الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية

تكامل سير العمل والمسار التحليلي

التأثير التشغيلي والمؤسسي

اعتبارات التنفيذ

الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية