عزل الخلايا النجمية: طريقة للحصول على تحضير نقي للخلايا النجمية القشرية للفأر

تساعد الخلايا النجمية في الثقافة المختبرية على التحقيق في الدور البيولوجي للخلايا النجمية - خلايا الدماغ الأكثر وفرة.

ابدأ بدماغ فأر حديثي الولادة يوضع تحت مجهر تشريح.

قم بإزالة البصيلات الشمية والمخيخ.

قم بإجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية لفصل القشرة.

قم بإزالة السحايا لتجنب التلوث في ثقافة الخلايا النجمية من الخلايا الليفية والخلايا السحائية.

انقل نصفي القشرة المخية إلى وسط مثلج وفرم إلى قطع صغيرة.

اجمع القطع القشرية في أنبوب يحتوي على التربسين. التربسين ، إنزيم البروتياز ، يهضم بروتينات التصاق الخلية ، مما يسهل فصل الخلايا.

جهاز طرد مركزي لحبيبات الأنسجة المهضومة.

قم بإزالة المادة الطافية وأضف وسط الخلايا النجمية إلى الحبيبات. الماصة بقوة لإطلاق مجموعة خلايا مختلطة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا السلائف قليلة التغصن أو OPCs.

بذر هذا المعلق الخلية في قارورة ثقافة الأنسجة المطلية بالبولي يسين واحتضنها.

ترتبط الخلايا سالبة الشحنة بالبولي ليسين موجب الشحنة وتنمو على السطح بأكمله لتشكيل طبقة ملتقية.

رج القارورة لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة المربوطة بشكل فضفاض و OPCs. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على خلايا منفصلة.

أضف التربسين إلى طبقة الخلايا النجمية. اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات وقسم الخلايا النجمية إلى قوارير متعددة.

أخيرا ، قم بتقييم نقاء ثقافة الخلايا النجمية عن طريق تلطيخ العلامات الخاصة بالخلايا المناعية.

انقل الطبق الذي يحتوي على الأدمغة إلى مجهر مجسم. بعد ذلك ، لعزل القشرة ، أمسك الطرف الخلفي لكل دماغ بالملقط الدقيق وقم بإجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.

بعد ذلك ، أدخل مجموعة ثانية من الملقط في الأخدود الذي تم إنشاؤه وقم بإزالة الهيكل الشبيه بالصفيحة للقشرة من بقية الدماغ.

بمجرد عزل جميع القشرة ، قم بتقشير السحايا بعناية بعيدا عن القشرة عن طريق السحب بالملقط الناعم. تتجنب هذه الخطوة تلوث ثقافة الخلايا النجمية النهائية بالخلايا السحائية والخلايا الليفية.

انقلي نصفي الكرة الأرضية المحضرين إلى طبق ثان مليء ب HBSS المبرد وضعيه على الثلج. استمر وفقا لذلك مع جميع القشرة الأربعة. أخيرا ، قم بتقطيع كل نصف كرة إلى أربع إلى ثماني قطع صغيرة باستخدام شفرات حادة.

في ظل ظروف معقمة ، انقل قطع القشرة إلى أنبوب فالكون واحد سعة 50 مليلتر وأضف HBSS إلى الحجم النهائي البالغ 22.5 ملليلترا. ثم أضف 2.5 مل من 2.5٪ تربسين.

استبدل الغطاء واخلطه واحتضنه في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تخلط عن طريق رجها كل 10 دقائق. ثم ، بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم لتكوير قطع أنسجة القشرة ، قم بصب المادة الطافية بعناية.

أضف 10 ملليلتر من وسط طلاء الخلايا النجمية إلى الحبيبات ، واستخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لسحب الوسط الذي يحتوي على الأنسجة لأعلى ولأسفل بقوة 20 إلى 30 مرة حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.

بعد ذلك ، أضف وسيط طلاء الخلايا النجمية إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي وفقا للإجراءات القياسية.

يجب أن ينتج عن تحضير واحد من أربعة قشور جرو فأر من 10 إلى 15 مرة 10 إلى الخلايا المفردة السادسة المنفصلة. أخيرا ، استنشق poly-D-lysine من قارورة معدة مسبقا وانقل تعليق الخلية المنفصلة إلى القارورة.

احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة يومين ثم قم بتغيير الوسائط. يجب بعد ذلك تغيير الوسائط كل 3 أيام بعد ذلك.

يجب أن تظهر الخلايا النجمية متقاربة مع طبقة علوية من الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 7 إلى 8 أيام في الثقافة. في هذه المرحلة ، اضبط قارورة T75 على شاكر مداري مضبوطة على 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة.

تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة أو قم بتدويرها لأسفل وطبقها للاستزراع. بعد ذلك ، أضف 20 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية الطازجة واستمر في هز القارورة عند 240 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات لإزالة الخلايا السلائف قليلة التغصن.

نظرا لأن بعض OPCs لن تنفصل تماما عن طبقة الخلايا النجمية ، استمر في الاهتزاز بقوة باليد لمدة 1 دقيقة من أجل منع تلوث OPC. مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية أو قم بتدويرها على طبق لزراعة OPCs.

اشطف طبقة الخلايا النجمية المتبقية مرتين باستخدام PBS. قم بشفط PBS وأضف 5 ملليلتر من التربسين EDTA. احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية.

تحقق من انفصال الخلايا النجمية كل 5 دقائق وفرض انفصال الخلايا النجمية عن طريق ضرب القارورة على راحة يدك مرتين إلى ثلاث مرات.

بمجرد انفصال الخلايا النجمية عن القارورة ، أضف 5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا النجومية. قم بتدوير الخلايا عند 180 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشق المادة الطافية ، وأضف 40 مل من وسط طلاء الخلايا النجمية الطازجة.

يجب أن تنتج قارورة T75 واحدة من الخلايا القشرية المختلطة حوالي 1 في 10 إلى الخلايا السادسة المخصبة للخلايا النجمية بعد المقطع الأول.