عزل خلايا الدماغ من يرقات الزرد: تقنية للحصول على الخلايا العصبية السليمة والضامة والخلايا الدبقية الصغيرة من أنسجة دماغ أسماك الزرد

يتكون دماغ سمك الزرد من الخلايا العصبية - الخلايا العصبية التي تلعب دورا بارزا في معالجة المعلومات. بالإضافة إلى ذلك ، فهو يتألف من مجموعة من الخلايا المناعية الداعمة ، بما في ذلك البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة ، التي تعيش في الفضاء العصبي الداخلي.

لعزل كل هذه الأنواع من خلايا الدماغ عن سمكة الزرد ، أولا ، خذ يرقات الزرد المخدرة في طبق بتري يحتوي على وسائط مناسبة.

تخيل سمك الزرد تحت مجهر مجسمة وقم بتمرير رؤوس اليرقات فوق كيس الصفار للحفاظ على الدماغ سليما.

انقل الرؤوس المقطوعة إلى مجانس مملوء بوسائط مبردة مسبقا ، موضوعة على الثلج. تساعد درجة الحرارة المنخفضة على منع تدهور خلايا الدماغ.

باستخدام مدقة ، قم بتجانس أنسجة دماغ الزرد. يؤدي التجانس إلى تفكيك المصفوفة خارج الخلية ويبدأ في تفكك الخلايا العصبية والضامة والخلايا الدبقية الصغيرة من أنسجة المخ.

تفصل هذه الخطوة أيضا المايلين - طبقة عازلة غنية بالدهون - عن الخلايا العصبية.

مرر الجانس عبر مصفاة لمحاصرة كتل الخلايا الكبيرة.

الطرد المركزي المرشح لتكوير الخلايا وشظايا غمد المايلين. تخلص من المادة الطافية المحتوية على الحطام.

أعد تعليق الحبيبات في وسط تدرج كثافة مناسب وتراكبها بمخزن مؤقت.

قم بتدوير الأنبوب بسرعة منخفضة. تشكل شظايا المايلين الأخف نطاقا مميزا عند واجهة المخزن المؤقت ووسط تدرج الكثافة ، بينما تستقر الخلايا الأكثر كثافة في الأسفل.

استنشق الطبقات العليا وأعد تعليق خلايا الدماغ في وسائط جديدة لمزيد من الاستخدام.

أضف 1.5 مل من 15 ملليمولار تريكايين لكل 50 مل من اليرقات المتوسطة إلى 50 اليرقات لتحضير التخدير. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور سعة 3 ملليلتر لنقل 10 يرقات في المرة الواحدة إلى طبق بتري مقاس 55 ملم مليء بوسط E3 المثلج مع التريكايين لتخديرها بشكل نهائي.

تحت المجهر المجسم ، قم بمحاذاة 10 يرقات في وسط طبق بتري. ثم ، باستخدام مقص جراحي ، قم بتمرير رؤوس اليرقات فوق كيس الصفار.

باستخدام ماصة باستور سعة 3 ملليلتر، امتلك جميع الرؤوس، وبأقل قدر ممكن من السوائل، انقلها إلى مجانس زجاجي على ثلج يحتوي على 1 ملليلتر من الوسائط المثلجة A.

استبدل كل طبق بتري صغير يحتوي على E3 المثلج بالإضافة إلى التريكايين بطبق جديد كل 30 دقيقة للتأكد من إجراء التشريح في وسط E3 البارد بالإضافة إلى التريكايين.

استبدل الوسائط المثلجة A في الخالط الزجاجي عندما يبدأ اللون في التلاشي. بمجرد جمع مجموعة الرؤوس بأكملها ، قم بإزالة كل الوسائط A من الخالط الزجاجي واستبدله ب 1 مليلتر من الوسائط المثلجة الطازجة A.

مع بقاء الخالط على الجليد ، استخدم مدقة محكمة الغلق لتعطيل أنسجة المخ عن طريق إجراء 40 جولة من التكسير واللفات ل 3 إلى 5 يرقات dpf و 50 طلقة ليرقات 7 و 8 dpf.

ثم أضف 2 مل من الوسائط A إلى تعليق الخلية لتخفيف الخلايا وتقليل تكاثرها بالمايلين. تخلص من تكتل الخلايا عن طريق تشغيل معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب صقر بارد سعة 50 مليلتر على الجليد. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.

انقل 1 مليلتر من معلق الخلية إلى أنابيب باردة 1.5 ملم ، وقم بتدويرها عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر بإبرة 23 جم × 1 بوصة ، قم بإزالة المادة الطافية.

مع 1 ملليلتر من وسط التدرج الكثيف المثلج بنسبة 22٪ ، متراكب برفق بمقدار 0.5 مل من 1x DPBS المثلج ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق. قم بتدوير الأنابيب عند 950 × جم دون انقطاع وتسارع بطيء عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الدوران ، تخلص من وسط تدرج كثافة DPBS والمايلين المحبوس في الواجهة. بعد ذلك ، استخدم 0.5 ملم من الوسائط A مع 2٪ NGS لغسل الخلايا وتدوير الأنابيب عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، ثم اسحب كريات الخلية من نفس الحالة التجريبية معا في 1 مليلتر من الوسائط A مع 2٪ NGS.

إذا كانت الخلايا ذات الأهمية تعبر عن بروتين فلوري ، فقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرون وقم بنقلها إلى أنابيب FACS باردة سعة 5 ملليلتر على الجليد المحمي من الضوء.