توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs) من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMNCs): إجراء قائم على فيروس سينداي لإعادة برمجة الخلايا الجذعية العصبية المستحثة في الخلايا الجذعية العصبية المحيطية في الخلايا الجذعية العصبية المحيطية

لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية عصبية مستحثة أو iNSCs - الخلايا الجذعية التي تمتلك قدرة عالية على التجديد الذاتي والتمايز ، ابدأ بزراعة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة في وسط خال من المصل لتوسيع الأرومات الحمراء.

بعد ذلك ، قم بتثبيت معلق الأرومة الحمراء في صفيحة ثقافة. عالج الخلايا بفيروس سينداي المؤتلف أو SeV. تقوم هذه الفيروسات بتشفير عوامل إعادة برمجة النسخ. أجهزة الطرد المركزي لترسيب الخلايا واحتضانها.

بعد اندماج SeV في غشاء الخلية المضيفة ، يخضع جينوم الفيروس للنسخ متبوعا بالترجمة في السيتوبلازم. يؤدي التعبير خارج الرحم لعوامل النسخ إلى تشغيل عملية إعادة برمجة الخلية دون دمج الجينات في جينوم المضيف.

الآن ، قم بالطرد المركزي للثقافة لإزالة الفيروسات. أعد تعليق الخلايا المنقولة في وسط مناسب ، متبوعا بالطلاء. علاوة على ذلك ، جهاز الطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي. قم بإعادة تعليق الخلايا في وسائط iNSC.

بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في طبق مغطى بالبروتين. تلتصق الخلايا بطبقة البروتين في اللوحة. استكمل الخلايا الملتصقة بوسائط iNSC في أيام بديلة. بعد أسبوع من الثقافة ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسائط iNSC جديدة يوميا.

تحافظ عوامل النمو والمكونات الكيميائية في الوسائط على التجديد الذاتي وتدعم تعدد القدرات لمجموعة فرعية من الخلايا المنقولة ، وتعيد برمجتها بالكامل إلى iNSCs. بمرور الوقت ، تبدأ الخلايا في تكوين مستعمرات iNSC. حدد المستعمرات المرغوبة للزراعة.

في اليوم 0 ، اجمع الخلايا في وسط MNC وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا ب 1 ملليلتر من وسط MNC الدافئ مسبقا. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام Trypan Blue ثم أعد تعليقها بوسط MNC الدافئ مسبقا إلى تركيز 200,000 خلية لكل بئر في 24 بئرا من الألواح المكونة من 24 بئرا.

قم بإذابة الأنابيب التي تمت إزالتها من التخزين المنخفض 80 درجة مئوية المحتوية على فيروس سينداي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 ثوان ثم اتركها لتذوب في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابتها ، ضعها على الفور على الجليد. أضف فيروس سينداي المذاب إلى آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا مع MNCs بعدد متعدد من العدوى 10. لتسهيل ربط الخلايا ، قم بالطرد المركزي للألواح عند 1,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك ، ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم 1 ، انقل الخلايا ذات الوسيط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. لفصل الخلايا المتبقية بشكل أكبر ، اشطف الآبار ب 1 ملليلتر من وسط MNC لكل بئر وأضف الخلايا ذات الوسط إلى الأنبوب. بعد الطرد المركزي لتعليق الخلية هذا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من وسط MNC الطازج الدافئ مسبقا وأضفه إلى بئر من لوحة 24 بئرا.

في اليوم 2 ، استخدم 1 مليلتر لكل بئر من 50 ميكروغراما مخففا مسبقا لكل ميكرولتر بولي دي ليسين و D-PBS لطلاء ألواح 6 آبار لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. استنشق بولي دي ليسين من الألواح المكونة من 6 آبار وجففها على المقعد العمودي النظيف لمدة 10 دقائق تقريبا. ثم أضف 1 مليلتر لكل بئر من 5 ميكروغرام مخففة مسبقا لكل مليلتر من اللامينين إلى الألواح المكونة من 6 آبار واحتضانها لمدة 4 إلى 6 ساعات عند 37 درجة مئوية لتغطيتها. اغسل الأطباق باستخدام D-PBS قبل الاستخدام.

في اليوم 3 ، تم تحويل جميع الفيروسات متعددة الجنسيات إلى فيروس سينداي في وسط الخلايا الجذعية العصبية المستحثة على ألواح 6 آبار مطلية ب poly-D-lysine laminin. في اليومين 5 و 7 ، أضف برفق 1 مليلتر من 37 درجة مئوية وسط iNSC الدافئ مسبقا إلى كل بئر من الألواح المكونة من 6 آبار.

من اليوم 9 إلى اليوم 28 ، استبدل الوسط بوسيط iNSC طازج مسخن مسبقا يوميا. راقب ظهور مستعمرات iNSC ، وفي حوالي 2 إلى 3 أسابيع ، اختر المستعمرات ذات التشكل المناسب باستخدام الماصات الزجاجية المحترقة. بعد ذلك ، انقل كل مستعمرة إلى بئر منفصل من صفيحة 6 آبار للتوسع.