عزل الشعيرات الدموية الدماغية عن الدماغ البشري: طريقة محسنة لاستخراج الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة الدماغ البشري

الشعيرات الدموية الدماغية هي عنصر حيوي في الحاجز الدموي الدماغي - حاجز شبه منفذ يسمح بالحركة الانتقائية للمواد المذابة بين الدم والدماغ. لعزل الشعيرات الدموية الدماغية ، ابدأ بأنسجة المخ البشرية الطازجة. قم بإزالة السحايا وقطع المادة البيضاء.

افرم أنسجة المخ إلى أجزاء أصغر. انقل الأجزاء إلى الخالط الذي يحتوي على مخزن مؤقت مناسب وتجانس. يؤدي التجانس إلى تفكيك الأنسجة ، وإطلاق الشعيرات الدموية وحطام الأنسجة في المحلول.

انقل الجانس إلى أنبوب جديد وأضف الحجم الأمثل لوسط تدرج الكثافة المناسب. الطرد المركزي الحل لحبيبات الشعيرات الدموية. ينتج عن وسط تدرج الكثافة الزائد أو القليل جدا انخفاض الإنتاجية الشعرية. قم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في ألبومين مصل الأبقار أو المخزن المؤقت المكممل ب BSA. يعمل BSA على استقرار الإنزيمات الهاضمة والحفاظ على السلامة الهيكلية للشعيرات الدموية. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول بمرشح مناسب لإزالة الأوعية الكبيرة وحطام الأنسجة.

ثم قم بتمرير المرشح من خلال مرشح شبكي أصغر. يحتفظ هذا المرشح بالشعيرات الدموية الدماغية ويسمح بمرور الحطام الأصغر وخلايا الدم الحمراء. بعد ذلك ، اقلب الفلتر واغسل الشعيرات الدموية في أنبوب جديد مع مخزن مؤقت مكمل ب BSA.

الطرد المركزي المحلول وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الشعيرات الدموية النقية في المخزن المؤقت وقم بتخزينها لمزيد من الاستخدام.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتوثيق وزن أنسجة المخ البشري ، والتي يجب أن تكون حوالي 10 جرامات. تحت المجهر ، قم بإزالة جميع السحايا بعناية باستخدام ملقط ، واستخدم مشرطا لقطع المادة البيضاء. ثم قم بتقطيع أنسجة المخ بعناية وفرمها بمشرط لمدة 5 دقائق.

انقل أنسجة المخ إلى طاحونة الأنسجة وأضف 30 مل من المخزن المؤقت للعزل. بعد ذلك ، قم بتجانس كل عينة ب 100 ضربة عند 50 دورة في الدقيقة. لا تقلب في الهواء لمنع الفقاعات. قم بتوثيق الوقت كل 25 ضربة والوقت الإجمالي اللازم ل 100 ضربة. بعد ذلك ، انقل المتجانس إلى الخالط Dounce على الجليد. قم بتجانس التعليق لحوالي 20 ضربة وتجنب الفقاعات.

بعد ذلك ، قم بتوزيع الدماغ المتجانس بالتساوي في أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وتوثيق الحجم الكلي للتجانس. تأكد من إضافة الحجم الصحيح ل Ficoll. سيؤدي القليل جدا أو الكثير من Ficoll إلى كثافة غير صحيحة لفصل الشعيرات الدموية عن الحطام الخلوي وبالتالي سيقلل من الحبيبات الشعرية ويحد من المحصول.

استخدم 10 مل من عازلة العزل لشطف المدقة والمجانس وتوزيعها في أنابيب الطرد المركزي الأربعة. بعد ذلك ، قم بتوزيع 50 مل من عازلة تدرج الكثافة في أنابيب الطرد المركزي. أغلق أنابيب الطرد المركزي بإحكام بأغطية. بعد ذلك ، امزج الوسط المتجانس ووسط تدرج الكثافة والمخزن المؤقت عن طريق هز الأنابيب بقوة. جهاز طرد مركزي عند 5,800 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 2 ملليلتر من 1٪ BSA.

بعد إعادة تعليق الحبيبات ، قم بتصفية التعليق من خلال شبكة 300 ميكرومتر. يتم ترشيح الشعيرات الدموية من خلال الشبكة ، بينما تبقى الأوعية الكبيرة وحطام الدماغ الأكبر على الشبكة. اغسل الشبكة بعناية بما يصل إلى 50 مل من BSA بنسبة 1٪ ، ثم تخلص من الشبكة. لفصل الشعيرات الدموية عن خلايا الدم الحمراء وبقايا الدماغ الأخرى ، قم بتوزيع مرشحات الترشيح الشعري على مرشحات سلالة الخلايا 530 ميكرومتر.

يتم إعاقة الشعيرات الدموية بواسطة هذا المرشح ، بينما تمر خلايا الدم الحمراء والخلايا المفردة الأخرى وبقايا الدماغ الصغيرة عبر المرشح ويتم جمعها في المرشح. بعد ذلك ، اغسل كل مرشح ب 25 مل من 1٪ BSA. صب جميع المرشحات فوق المرشح السادس لزيادة المحصول. اغسل كل مرشح ب 50 مل من 1٪ BSA. احتفظ بمرشحات سلالة الخلية التي تحتوي على الشعيرات الدموية وتخلص من المرشح. بعد ذلك ، اقلب المرشحات رأسا على عقب واغسل الشعيرات الدموية ب 50 مل من 1٪ BSA إلى أنابيب سعة 50 ملليلترا.

اضغط برفق باستخدام طرف الماصة وحركها عبر الفلتر لغسل الشعيرات الدموية في الدماغ. تأكد من غسل جميع الشعيرات الدموية في الدماغ، خاصة من حافة الفلتر. تجنب الفقاعات لأن هذا يجعل عملية الترشيح أكثر صعوبة ويزيد من فرصة فقدان الشعيرات الدموية. بعد جمع الشعيرات الدموية ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات عند 1,500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في حوالي 3 ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل.

بعد ذلك ، اجمع جميع الكريات المعلقة من عينة واحدة في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر واملأها بمخزن عازل للعزل. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 1,500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية واغسله مرتين أخريين. قم بتوثيق نقاء الشعيرات الدموية باستخدام مجهر بتكبير 100X وكاميرا. يمكن الآن استخدام الشعيرات الدموية الدماغية المعزولة في التجارب ، أو معالجتها أو تجميدها السريع ، وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في أنابيب التبريد لمدة لا تقل عن 6 إلى 12 شهرا.