موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:05 دقيقة • July 8th, 2025
التصوير بالزيفوغرافيا هو تقنية كهربائية تتضمن ركيزة بروتينية مبلمرة مع هلام بولي أكريلاميد للكشف عن الإنزيمات المحللة للطاقة المائية ونشاطها. للبدء ، قم بإذابة العينات في مخزن مؤقت لتصوير الزيموغرافية يحتوي على الجلسرين وكبريتات دوديسيل الصوديوم أو SDS والبروموفينول الأزرق.
يجعل الجلسرين عازلة العينة أكثر كثافة من المخزن المؤقت المحيط للهلام ، مما يتيح سهولة التحميل في جيوب الجل. SDS - منظف أنيوني - يفسد طبيعة الإنزيمات الموجودة في العينة ويغطيها بشحنة سالبة. يساعد البروموفينول الأزرق - صبغة تتبع - على مراقبة تقدم العينة في الجل.
قم بتحميل العينات في هلام بولي أكريلاميد مدمج بركائز فلوروجينيك للكشف عن نشاط البروتياز. الآن ، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية وابدأ الرحلان الكهربائي. يتسبب المجال الكهربائي المتولد في هجرة جميع الإنزيمات المرتبطة ب SDS عبر الهلام باتجاه القطب موجب الشحنة.
بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل واغسله في مخزن مؤقت يحتوي على منظف غير أيوني يزيح SDS للسماح بإعادة تكوين الإنزيم. بعد ذلك ، احتضان الجل في مخزن مؤقت نامي يحتوي على كاتيونات ثنائية التكافؤ تنشط الإنزيمات الموجودة في الجل.
تشق البروتياز النشط ركائز الفلوروجين ، مما يتسبب في زيادة التألق. قم بتصوير الجل لمراقبة نطاقات البروتين الفلورية التي تتناسب شدتها مع نشاط البروتياز.
للبدء ، قم بإذابة العينات في المخزن المؤقت لعينة الزيموغرافيا التقليدية. أضف 400 مل من 1x Tris-Glycine SDS تشغيل المخزن المؤقت إلى جهاز الجل. قم بتحميل ما يصل إلى 35 ميكرولتر من العينة لكل بئر. قم بتشغيل العينات عند 120 فولت عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة أو حتى تشير معايير الوزن الجزيئي إلى أن البروتياز محل الاهتمام يقع ضمن طبقة هلام حل الببتيد. بعد ذلك ، قم بإزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيكي.
اغسل المواد الهلامية ثلاث مرات في محلول إعادة التشكيل في درجة حرارة الغرفة تحت تقليب لطيف ، مع كل غسلة لمدة 10 دقائق. انقل المواد الهلامية إلى محلول عازل متطور لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل المحلول بمخزن مؤقت جديد واحتضانه عند 37 درجة مئوية تحت تحريض لطيف لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، استخدم ماسح ضوئي / تصوير هلام فلورسنت مع مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة لتصوير المواد الهلامية.