في توصيل الجينات القائم على التثقيب الكهربائي في الرحم: تقنية لحقن الحمض النووي البلازميد في الخلايا المخيخية الجنينية لأجنة الفئران

ابدأ بأخذ نموذج فأر مخدر حامل يوضع في وضع ضعيف. تحضير الماوس عن طريق إزالة الشعر من منطقة البطن. شق الجلد وطبقات العضلات الأساسية لفضح قرون الرحم - المواقع التي تستضيف أجنة قابلة للحياة.

الآن ، اسحب قرون الرحم من تجويف البطن. خذ شعيرات دموية زجاجية ذات طرف حاد تحتوي على محلول الحمض النووي البلازميد المطلوب. حدد موقع دماغ الجنين وحقن محلول الحمض النووي البلازميد من خلال جدار الرحم في البطين الرابع. هذا الموضع هو الأمامي للمخيخ الأولي - الموقع المطلوب لتسليم الحمض النووي في نهاية المطاف.

بعد الحقن ، اسحب الشعيرات الدموية الفارغة. بعد ذلك ، من أجل التثقيب الكهربائي للجنين المحقون بالحمض النووي ، ضع القطبين فوق جدار الرحم بحيث يغطي القطب الموجب البدائية المخيخية ويغطي القطب السالب المنطقة المحيطة بالأذنين.

تطبيق نبضات كهربائية للمدة المطلوبة. هذه النبضات تجعل الخلايا العصبية المخيخية قابلة للاختراق ، مما يسمح للحمض النووي البلازميد بدخول الخلايا المستهدفة. أخيرا ، ضع قرون الرحم مرة أخرى داخل تجويف البطن في موضعها الطبيعي. قم بخياطة الجروح ، وانقل الماوس إلى قفصه ، واتركه يتعافى.

ابدأ بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات في مجتذب ماصة دقيقة وسحبها لإنشاء طرف رفيع. قم بتسمية الطرف الشعري بالحبر الأسود للحصول على تصور أفضل أثناء الحقن وارسم تحجيما على الزجاج. من خلال العمل تحت المجهر المجسم ، استخدم مسطرة وملاقط إبرة حادة لتقليم الطرف بطول حوالي 6 ملليمترات وإنشاء حافة مشطوفة حادة من جانب واحد.

قم بتصفية محلول مخزون Fast Green بنسبة 1٪ من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة جزيئات الصبغة من المحلول. امزج بلازميدات الحمض النووي الريبي أحادية التوجيه في أجزاء متساوية مع بلازميد مراسل لوسيفيراز إلى تركيز نهائي لا يقل عن 1 ميكروغرام لكل مليلتر لكل بلازميد.

قم بتلوين محلول البلازما باللون الأخضر السريع بتركيز نهائي قدره 0.05٪. بعد تخدير فأر CD-1 حامل بالأيزوفلوران ، ضع الفأر على ظهره على وسادة تدفئة وقم بإعطاء المسكن. ضع مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة. ثبت الأطراف بشريط لاصق وتعقيم البطن بمطهر.

قم بتغطية الماوس بالشاش ، مع ترك المنطقة الجراحية فقط مكشوفة. بعد عمل شق جلدي يبلغ طوله حوالي 2 سم ، حدد موقع linea alba واستخدم مقص مناديل غير حاد لعمل شق ثان أصغر قليلا عبر الصفاق. بلل تجويف البطن المفتوح باستخدام PBS معقم مسخن مسبقا.

بعد ذلك ، استخدم ملقط حلقي لاستخراج قرون الرحم بعناية من تجويف البطن. أمسك جدار الرحم عند الفجوة بين أكياس صفار البيض لجنينين متجاورين واسحبها برفق. تجنب أي ضغط على الجنين أثناء سحبه عبر الشق. بمجرد استخراج قرون الرحم ، استنشق ما يقرب من 10 إلى 15 ميكرولترا من محلول البلازميد الملون باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المحضرة. تجنب أي فقاعات هواء أثناء هذه العملية.

أمسك الجنين برفق باستخدام ملقط حلقي وحدد موقع منطقة الرقبة. اخترق الدماغ الخلفي الظهري ببطء بطرف الشعيرات الدموية الزجاجية وانتقل إلى البطين الرابع. حقن حوالي 1 ميكرولتر من مزيج البلازميد. تأكد من أن الحمض النووي المصبوغ لم يتسرب من الدماغ ويمكن رؤيته كهيكل على شكل ماسي.

هنا ، من المهم للغاية ملء منطقة البطين الرابع بأكملها بمحلول البلازميد لتوصيل الحمض النووي أيضا إلى الجزء البعيد من البدائية المخيخية. في الوقت نفسه ، تأكد من عدم التسبب في أي نزيف أثناء هذه العملية.

ضع ملاقط بلاتينية مزودة بألواح قطب كهربائي قطرها 5 ملم بشكل جانبي فوق رأس الجنين مع تغطية القطب السالب للأذن والقطب الموجب الموضوع في البدائية المخيخية فوق جدار الرحم وتطبيق نبضات مربعة كهربائية.

عندما يتم تثقيب جميع الأجنة بالكهرباء ، ضع قرون الرحم بحذر مرة أخرى في تجويف البطن واملأها ب PBS المعقم. دع قرن الرحم ينزلق إلى وضع طبيعي. قم بإيقاف تشغيل التخدير وضع بطن لأسفل في قفص جديد للتعافي.