تحريض الورم الأرومي الدبقي باستخدام التبديل بوساطة SB: تقنية لتوليد نموذج فأر جديد باستخدام التكامل بوساطة الينقولات لبلازميد SB في دماغ الفأر حديثي الولادة

ابدأ بأخذ أنبوب يحتوي على مزيج من البلازميدات. تم تصميم البلازميد النائم أو الينقولات SB لحمل عنصر قابل للنقل يشتمل على جين ورمي مسرطن مشتق من الإنسان محصور بين تسلسلين متكررين مقلوبين. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي هذا المزيج على بلازميد SB transposase الذي يحتوي على عنصر تعبير عن إنزيم الترانسبوزياز.

الآن ، أضف كاشف تعداء مناسبا إلى الأنبوب. استنشق مزيج الحقن في حقنة مزودة بإبرة دقيقة. بعد ذلك ، قم بتأمين جرو فأر مخدر في وضع الانبطاح على إطار تجسيم. تخيل منطقة رأس الجرو لتحديد موقع خيوط الجمجمة. ضع الإبرة الدقيقة فوق خيوط الجمجمة.

حقن المزيج في البطين الجانبي - تجويف داخل حمة الدماغ. بعد ذلك ، يتشتت المحلول في حمة الدماغ ، حيث تسهل جزيئات كاشف التعداء دخول البلازميدات داخل الخلايا. بمجرد دخوله الخلية ، يعبر بلازميد الترانسبوزاز عن جزيئات إنزيم الينقولاز ، والتي تتعرف على تسلسلات التكرار المقلوبة وتستأصل عنصر الينقولات.

ثم يعيد الحمض النووي للعنصر القابل للنقل دمج نفسه في منطقة تكرار TA من الحمض النووي الجيني للجرو. يؤدي التبديل الجيني إلى تحول مسرطن لخلايا الدماغ ، مما يؤدي إلى تطور الورم الأرومي الدبقي في دماغ الفأر.

قبل 3 إلى 4 أسابيع من التجربة ، قم بإعداد قفص تربية الفئران مع ذكر واحد وأنثى واحدة. قم بتضمين كوخ الإسكيمو البلاستيكي الملون لإثراء البيئة وزيادة فرص التزاوج. قم بإزالة الذكر بمجرد تأكيد الحمل ، وبعد 18 يوما من يوم التزاوج ، ابدأ في مراقبة الأنثى للولادة. تأكد من توفر الأم البديلة في وقت قريب من الولادة.

في اليوم الأول بعد الولادة ، قم بإجراء الحقن داخل البطينين. قم بإعداد محلول الحقن عن طريق نقل 20 ميكرولترا من مزيج الحمض النووي الذي يحتوي على بلازميدات الينقولات بتركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول PEI إلى محلول الحمض النووي واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة إلى ساعة وبعد ذلك يجب تخزين المزيج على الثلج.

بالنسبة لإبرة الحقن ، قم بتوصيل حقنة سعة 10 ميكرولتر بإبرة تحت الجلد قياس 30 مشطوفة عند 12.5 درجة. ثم قم بتوصيل المحقنة بمضخة بالحقن التلقائي. اختبر الإعداد ب 10 ميكرولتر من الماء وتأكد من إفراغ المحقنة. الآن ، قم بتبريد المرحلة التجسيمية لحديثي الولادة بملاط من الثلج الجاف والكحول. عندما يتم تبريده إلى ما بين 2 و 8 درجات مئوية ، تابع الحقن.

قم بتخدير الجرو عن طريق وضعه على الجليد لمدة دقيقتين. أثناء وجود الجرو على الجليد ، قم بتحميل المحقنة بمحلول الحقن. بمجرد التخدير ، انقل الجرو إلى الإطار وقم بتثبيت رأسه بين قضبان الأذن المغطاة بالشاش. تأكد من أن الجانب الظهري للجمجمة أفقي وموازي لسطح الإطار. أيضا ، يجب أن تكون خيوط الجمجمة مرئية بوضوح.

إذا لم يتم تثبيت رأس الجرو بقوة كافية ، فسوف يتحرك أثناء الحقن ، بينما إذا تم ضغطه بقوة شديدة بين قضبان الأذن في الإطار ، فلن يكون لامدا مرئيا وسيجبر الضغط داخل الرأس المحلول المحقون على التسرب.

مع إمساك الجرو بإحكام بالإطار ، امسح رأسه بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، اخفض الإبرة واضبط موضعها بحيث تلامس لامدا. بعد ذلك ، ارفع الإبرة وحركها 0.8 ملم جانبيا و 1.5 ملم بشكل جانبي. ثم اخفضه مرة أخرى حتى يغمر الجلد قليلا. سجل إحداثيات هذا الموقف. بعد ذلك ، اخفض الإبرة بمقدار 1.5 ملم عبر الجلد والجمجمة إلى القشرة عند البطين الجانبي.

هناك ، قم بحقن 0.75 ميكرولتر على مدار 90 ثانية وانتظر دقيقة للسماح للمحلول بالتشتت. أثناء الانتظار ، يمكن تخدير الجرو التالي الذي سيتم حقنه. بعد الانتظار ، ارفع الإبرة ببطء. ثم انقل الجرو إلى موقع الاسترداد تحت مصباح تدفئة. يجب أن يكون الوقت من التخدير إلى الاحترار أقل من 10 دقائق ؛ أسرع كان ذلك أفضل.

راقب تنفسه ، وإذا لزم الأمر ، افرك الأطراف برفق لتحفيز التنفس. بمجرد تسخين الجرو ، يكون له لون وردي ونفس ثابت ، أعده إلى والدته.