التثقيب الكهربائي خارج الجسم الحي لشرائح مخيخ جنين الكتكوت: طريقة لإدخال الحمض النووي البلازميد الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر لتصور تطور الخلايا الحبيبية

الخلايا الحبيبية المخيخية هي أكثر أنواع الخلايا العصبية وفرة في الدماغ. تتكون الطبقة الحبيبية الخارجية ، EGL ، فقط من سلائف الخلايا الحبيبية ، GCPs ، التي تتمايز وتنتقل إلى الداخل لتشكيل الطبقة الحبيبية الداخلية ، IGL.

لتصور تطور الخلايا الحبيبية ، قم بإعداد غرفة التثقيب الكهربائي عن طريق ربط أنود بقاعدة طبق بتري. أضف وسيط الثقافة لتغطية القطب. الآن ، ضع إدراج ثقافة على القطب الكهربائي المغطى بالمتوسط. انقل شرائح مخيخ جنين الفرخ إلى إدراج المزرعة في اتجاه سهمي.

يسمح المستوى السهمي بتحديد الطبقة المستهدفة - EGL مقابل طبقات المخيخ المختلفة. أضف محلول صبغة لزج يحتوي على الحمض النووي البلازميد GFP عبر EGL. يشفر الحمض النووي البلازميد GFP لبروتين فلوري أخضر يوزع بشكل متجانس داخل سيتوبلازم الخلية ويتيح تصوير الخلايا الحية.

بعد ذلك ، ضع الكاثود في الوسط بالقرب من مخطط كهربية الدماغ ولكن ليس مباشرة على الأنسجة. ثم قم بتطبيق نبضات كهربائية متعددة على مناطق مختلفة من EGL. تحفز النبضات الكهربائية مسام مؤقتة في غشاء الخلية ، مما يسمح للخلايا بامتصاص الحمض النووي البلازميد. بعد ذلك ، يتيح الحمض النووي البلازميد التعبير عن GFP في الخلايا الحبيبية.

قم بتصوير الشرائح المخيخية تحت المجهر الفلوري لمراقبة تمايز الخلايا الحبيبية ونمط الهجرة عبر مراحل مختلفة من تطور الخلايا.

قم ببناء غرفة التثقيب الكهربائي عن طريق تثبيت أنود المثق الكهربائي على قاعدة طبق بتري مقاس 60 ملم باستخدام شريط عازل. أضف ما يقرب من 1 ملليلتر من HBSS لتغطية القطب. بعد ذلك ، ضع حشوة ثقافة 0.4 ميكرومتر أعلى القطب المغطى ب HBSS.

استخدم ماصة باستور سعة 3 ملليلتر برأس مقطوع لنقل الشرائح المحددة، حتى 5 لكل ملحق على ملحق المزرعة. بعد ذلك ، افصل الشرائح واتركها تستقر على إدراج الثقافة في اتجاه سهمي. باستخدام ماصة ، قم بإزالة الوسط الزائد من شرائح الدماغ. اسمح للملحق بالراحة على القطب الكهربائي بحيث يكون هناك اتصال بين الملحق والقطب.

في هذا الإعداد ، سيستقر إدراج الثقافة مع الشرائح على سطح الوسط ، مما يحافظ على الدائرة مع السماح بالاستهداف المكاني للكاثود. باستخدام طرف ماصة P10، قم بتعبئة 5 ميكرولترات من الحمض النووي المخفف بنسبة 20٪ باللون الأخضر السريع على سطح المنطقة المستهدفة من كل شريحة. تضمن إضافة Fast Green أن محلول الحمض النووي لزج بدرجة كافية لمنع تشتت الحمض النووي على نطاق واسع.

ثم ضع الكاثود فوق الأنسجة المستهدفة المرغوبة وقم بتقطيع العينات بالكهرباء. تجنب الاتصال المباشر للكاثود بالأنسجة عن طريق وضع الكاثود بالقرب من الأنسجة قدر الإمكان دون لمسه فعليا. كرر التثقيب الكهربائي في مناطق متعددة من الطبقة الحبيبية الخارجية على كل شريحة مخيخية فردية حسب الرغبة.

عند الانتهاء ، انقل ملحق المزرعة إلى طبق بتري مقاس 30 ملم. أضف إلى كل ثقافة 1 مليلتر من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا أسفل ملحق المزرعة. تأكد من أن الملحق لا يطفو على الوسط. يجب أن يكون ملحق الثقافة ملامسا للوسط ، ولكن لا ينبغي أن تستحم الشرائح فيه.